基于Keap1/Nrf2/HO-1通路汉黄芩素7-O-β-D-乙基葡萄糖醛酸苷体外抗氧化应激作用研究

目的 探讨汉黄芩素7-O-β-D-乙基葡萄糖醛酸苷(WODE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的抗氧化应激作用及机制.方法 MTS法检测WODE(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol·L-1)对RAW264.7细胞活力的影响;体外培养RAW264.7细胞,WODE(10、20、40μmol·L-1)或地塞米松(1μmol·L-1,阳性药)预处理1h,再给予LPS刺激24 h(造模过程不再加药),对照组不加LPS和受试物,模型组只给予LPS刺激;荧光探针检测胞内活性氧(ROS)水平;Griess反应测定细胞上清液中NO生成量;ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞内诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、醌氧化还原酶1(NQO-1)、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)的mRNA表达水平;Western blotting法检测细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达水平;免疫荧光染色法检测细胞内Kelch ECH相关蛋白1(Keap1)表达水平.结果 与对照组比较,WODE浓度小于40μmol·L-1时,细胞存活率没有明显变化;浓度大于80 μmol·L-1时,细胞存活率下降,但未见统计学差异.与模型组比较,WODE 10、20、40μmol·L-1组ROS水平显著降低(P＜0.01);20、40 μmol·L-1组NO释放显著降低(P＜0.05、0.01);40 μmol·L-1 组 iNOSmRNA 表达水平显著降低(P＜0.01);10、20、40 μmol·L-1 组 COX-2和20、40 μmol·L-1组IL-1βmRNA表达水平显著降低(P＜0.05、0.01);10、20、40μmo1·L-1组TNF-α和IL-6的释放受到显著抑制(P＜0.01);10、20、40 μmol·L-1组NQO-1mRNA表达水平显著升高(P＜0.01),40 μmol·L-1组SOD-1mRNA表达水平显著升高(P＜0.01);10、20、40 μmol·L-1组Keap1蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);10、20、40μmoI·L-1组HO-1蛋白和mRNA表达水平显著提高(P＜0.05、0.01);20、40 μmol·L-1组Nrf2蛋白和40μmol·L-1组Nrf2 mRNA表达水平显著增加(P＜0.01).结论 WODE对LPS诱导的RAW264.7细胞的氧化应激具有抑制作用,其作用机制可能与调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关.