烯醇化酶抑制剂对大鼠脊髓损伤后自噬及运动功能的影响

目的:探讨烯醇化酶（Enolase）抑制剂（ENOblock）对大鼠脊髓损伤后调控自噬相关蛋白表达及促进运动功能的影响。方法:选取160只雌性SD大鼠，按照随机数字表法分为假手术组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）自噬抑制剂处理组（3-MA组）、脊髓损伤组及ENOblock处理组（ENOblock组），每组40只。假手术组行背部椎板切除，但不损伤脊髓。3-MA组、脊髓损伤组和ENOblock组采用改良Allen法打击装置损伤T 8脊髓，建立脊髓损伤模型。3-MA组和ENOblock组分别在伤后立即向鼠尾静脉推注3-MA（2.5 mg/kg）和ENOblock（100 μg/kg）。假手术组和脊髓损伤组向鼠尾静脉推注等剂量的等渗氯化钠溶液。伤后1，3，7，14，21 d采用BBB评分评估各组双下肢运动功能。伤后3 d采用免疫印迹法检测各组微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ和LC3-Ⅰ比值、自噬效应蛋白（Beclin-1）和多泛素结合蛋白（p62）的表达量。伤后7 d采用免疫荧光法检测各组脊髓组织损伤区域LC3-Ⅱ和Beclin-1的阳性细胞。伤后3 d 采用RT-PCR检测各组脊髓组织损伤区域Beclin-1和Enolase mRNA的表达量。 结果:与假手术组［各时间点均为（21.0±0.0）分］比较，伤后1，3，7，14，21 d 3-MA组［（1.4±1.1）分、（2.4±0.9）分、（3.8±1.8）分、（7.6±1.1）分、（9.0±2.1）分］、脊髓损伤组［（0.8±0.5）分、（1.8±0.9）分、（3.6±0.9）分、（6.2±1.3）分、（8.0±0.7）分］和ENOblock组［（2.0±0.9）分、（2.2±0.8）分、（4.8±1.1）分、（10.6±1.5）分、（13.2±0.8）分］BBB评分降低（ P均<0.05）；伤后14，21 d ENOblock组BBB评分明显高于脊髓损伤组，伤后21 d 3-MA组BBB评分明显高于脊髓损伤组（ P均<0.05）。免疫印迹法检测显示，伤后3 d 假手术组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和p62表达量分别为0.46±0.10、0.41±0.03、0.81±0.03，3-MA组分别为0.66±0.06、0.69±0.02、0.59±0.05，脊髓损伤组分别为0.85±0.06、1.07±0.03、0.41±0.02，ENOblock组分别为0.68±0.06、0.66±0.08、0.55±0.02。与假手术组比较，脊髓损伤组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达量明显升高，p62表达量明显降低（ P均<0.05）；与脊髓损伤组比较，3-MA组和ENOblock组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达量降低，p62表达量升高（ P均<0.05）；3-MA组和ENOblock组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1和p62表达量差异无统计学意义（ P均 >0.05）。免疫荧光染色结果显示，伤后7 d 3-MA组和ENOblock组LC3-Ⅱ和Beclin-1阳性细胞比脊髓损伤组少。RT-PCR检测结果显示，与假手术组（0.25±0.06、0.29±0.03）比较，伤后3 d脊髓损伤组（1.08±0.16、0.98±0.17）Beclin-1和Enolase mRNA表达量升高（ P均<0.05）；与脊髓损伤组比较，伤后3 d 3-MA组（0.77±0.11、0.72±0.04）和ENOblock组（0.81±0.10、0.64±0.09）Beclin-1和Enolase mRNA表达量降低（ P均<0.05）；伤后3 d 3-MA组和ENOblock组Beclin-1和Enolase mRNA表达量差异无统计学意义（ P均 >0.05）。 结论:大鼠脊髓损伤后，神经元自噬活性明显增加，ENOblock可通过调控自噬相关蛋白的表达抑制神经元自噬并促进大鼠运动功能的恢复。