塞内卡病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为加强塞内卡病毒(SVA)在不同宿主的诊断及流行病学监测与防控,根据GenBank中发表的SVA VP1 基因区域设计一对特异性引物和带有Taq Man 发光基团标记的探针,构建重组阳性质粒并用作建立实时荧光定量RT-PCR方法的模板,对反应体系和条件进行优化,构建标准曲线并验证该方法的特异性、敏感性和重复性.结果显示,该方法的最适退火温度为 55℃,最佳引物和探针浓度分别为 0.2 μmol/L和 0.4 μmol/L,最佳反应循环数为 45,Ct值与标准品浓度的对数线性关系好.对猪源、鼠源及牛源 SVA和其他动物病毒(O 型口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、边界病毒、猪库布病毒、牛库布病毒、山羊鼻内肿瘤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛冠状病毒、D型流感病毒、蓝舌病毒)的核酸检测结果显示,除猪源、鼠源及牛源 SVA 为阳性外,其他病毒核酸为阴性.该方法最低检测限为 2.66×101 拷贝/μL,重复试验中组内和组间变异系数均小于 0.1％.建立的检测多宿主 SVA Taq Man RT-qPCR方法具有良好的特异性和稳定性,为SVA在不同宿主间的疾病诊断与流行病学调查或监控提供了快捷的方法.