低氧相关的R-脊椎蛋白3对人乳腺导管癌细胞增殖能力的影响及其机制

目的:体外观察低氧微环境对乳腺癌细胞增殖能力的影响，并探讨其分子机制。方法:细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)用于人乳腺导管癌细胞株(BT-474，购于中国科学院上海细胞库)经低氧处理后的增殖能力；应用基因芯片对低/常氧处理后的细胞进行差异基因的表达检测，并在体外行实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)验证；运用癌症基因组图谱(TCGA)及人类蛋白质表达图谱(HPA)数据库分析筛选的差异基因在乳癌及正常乳腺组织中的表达特征，并分析其水平与患者临床病理学特征及预后的相关性；基因组百科全书(KEGG)通路分析、基因过表达实验、蛋白质印迹法(Western blot)等方法探讨其发挥功能的分子机制，组间比较采用 t检验。 结果:BT-474细胞分别经常氧、低氧干预24、36、48 h后，常氧组中的吸光度值显著低于低氧组(0.32±0.03比0.40±0.02， t＝6.351；0.45±0.01比0.52±0.02， t＝4.196；0.57±0.04比0.68±0.03， t＝3.257； P<0.05)；基因芯片分析结果提示R-脊椎蛋白3(r-spondin3，RSPO3)是细胞经低氧处理后显著抑制表达的基因之一；进一步的RT-PCR结果示，低氧组中RSPO3的相对表达量显著低于常氧组(0.56±0.03比0.82±0.04， t＝12.583， P<0.05)；TCGA分析结果示RSPO3在乳腺癌组织中的表达量较乳腺正常组织显著降低(1.41±0.37比3.54±0.19， t＝14.648， P<0.01)，其在乳腺癌组织中表达水平与肿瘤的直径呈负相关( r＝－0.693， P<0.01)；生存分析结果表明，RSPO3低表达组中患者的总生存期(OS)显著低于高表达组[(46.52±0.28)个月比(53.79±0.47)个月， t＝21.357， P<0.01]；此外，KEGG分析结果表明，细胞经低氧处理后β-catenin通路被预测为显著激活；Western blot结果示低氧组细胞核内β-catenin的表达量较常氧组显著升高(0.89±0.06比0.42±0.02， t＝6.241， P<0.05)；与低氧组比较，低氧下过表达RSPO3后24、36、48 h后细胞的吸光度值显著降低(0.43±0.03比0.32±0.02， t＝4.458；0.51±0.01比0.39±0.02， t＝3.267；0.66±0.03比0.49±0.04， t＝4.103； P<0.05)，而在低氧处理同时上调RSPO3表达后核内β-catenin的水平却明显降低(0.93±0.05比0.38±0.07， t＝8.164， P<0.05)。 结论:低氧环境下BT-474细胞可能通过抑制RSPO3的表达，继而活化β-catenin通路促进乳腺癌细胞的增殖能力。