重组克柔念珠菌14-3-3蛋白诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制

旨在研究重组克柔念珠菌(Candida krusei)14-3-3蛋白(rCK14-3-3)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的分子机制,为系统研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供理论依据.采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定;CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间;Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响;ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、1L-12相对表达量的影响.结果显示:成功构建了 pET-21a-BMH1重组表达载体,经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,纯度达90％以上,浓度为0.2 mg·mL-1.与空白对照组相比,采用50 μg·mL-1的rCK14-3-3作用MAC-T,TLR2、TLR4、MyD88在1、3 h时表达量极显著升高(P＜0.01),6 h时,TLR4表达量显著降低(P＜0.05),TLR2、MyD88表达量无显著变化;p-JNK在1 h时的表达量无显著变化,3、6 h时极显著降低(P＜0.01);p-ERK在1、3、6 h时的表达量显著或极显著升高(P＜0.05,P＜0.01);p-p38在1 h时的表达水平极显著降低(P＜0.01),3、6 h时极显著升高(P＜0.01);p-IκB-α、p-p65在1、3、6 h时的表达量均极显著升高(P＜0.01).IL-1β、IFN-y、IL-18、TNF-α在作用1、3、6 h后均呈现出显著或极显著的上调趋势(P＜0.05,P＜0.01);IL-6在作用1、3 h后极显著上升(P＜0.01),6 h后显著降低(P＜0.05);IL-12在作用1 h后极显著上升(P＜0.01),3、6 h后极显著降低(P＜0.01).本研究成功表达具有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,该蛋白可通过TLR2/4-MAPK/NF-κB信号通路诱导MAC-T发生炎性反应,rCK14-3-3蛋白可作为引起MAC-T炎症的重要因子之一.