副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

[背景]副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的上呼吸道病原菌,引起格拉瑟氏病,主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病,通常见于5—8周龄的青年猪,发病率一般为10％—15％.该菌有15种血清型,目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型,是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一.目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒.[目的]研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒,为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持.[方法]表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白,使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白.以筛选的蛋白为包被抗原,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,优化间接ELISA反应条件,并组装试剂盒.在此基础上,确定该试剂盒的敏感性、特异性;通过对不同时间、不同猪场采集的2000份临床猪血清样本进行检测,评价该试剂盒的实用性;在以上临床血清样本中随机选取200份,分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测,比较检测结果,验证该试剂盒的符合率;最后,使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清,评价该菌免疫后的抗体消长规律.[结果]成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白,发现OppA免疫反应性和反应特异性最好.经过反应条件优化,确定OppA包被浓度为1μg·mL-1,封闭液为0.5％的BSA-PBS溶液,样品稀释液为1％的BSA-PBST溶液,样品孵育时间为30min,样品稀释度为1﹕50,酶标二抗孵育时间为30min,底物作用时间为15 min,临界值为0.18;试剂盒的敏感性和特异性为96.67％,能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应;2000份临床血清样本阳性检出率为34.65％;随机抽取200份血清样本,与间接血凝试验的符合率为92.50％,与进口商品化试剂盒符合率为87.00％,符合率较高;使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清,HPS抗体消长规律符合预期.[结论]研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强,与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高,可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价.