基于SIRT1/FoxO1通路探究小檗碱抑制卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的调节机制

目的:通过观察小檗碱(BBR)对卵巢颗粒细胞衰老的影响,探究其保护作用及调节机制.方法:应用H2O2诱导建立人卵巢颗粒样肿瘤(KGN)细胞衰老模型;设置空白组、模型组、BBR高剂量(1 μmol·L-1)组和BBR低剂量(0.5 μmol·L-1)组,模型组与BBR组加入浓度为10 μmol·L-1H2O2,孵育40 min.通过细胞增殖与活性检测(CCK-8)分析检测BBR对KGN细胞增殖的影响;通过β-半乳糖苷酶染色检测BBR对KGN细胞衰老状态的影响;应用流式细胞术检测BBR对KGN细胞凋亡和ROS含量的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测BBR对KGN细胞抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)/促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)比值、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、叉头框转录因子O1(FoxO1)及过氧化氢酶(CAT)mRNA表达的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测BBR对KGN细胞沉默信息调节因子1(SIRT1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、FoxO1、自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3BⅡ)、自噬关键分子酵母Atg6(Beclin-1)及泛素结合蛋白p62蛋白表达的影响.结果:H2O2诱导40 min后,与空白组比较,模型组细胞增殖率显著下降(P＜0.01);与模型组比较,BBR干预组细胞增殖率明显上升(P＜0.05);β-半乳糖苷酶染色结果显示,与空白组比较,模型组细胞呈现明显的衰老状态(P＜0.01),BBR干预组细胞衰老情况较模型组显著降低(P＜0.01);流式细胞术检测显示,与空白组比较,模型组细胞凋亡率显著上升(P＜0.01),BBR干预组细胞凋亡率较模型组明显降低(P＜0.05);同时,与空白组比较,模型组ROS含量显著增加(P＜0.01);与模型组比较,BBR干预组细胞ROS含量显著降低(P＜0.01);Real-time PCR结果显示,与空白组比较,模型组KGN细胞CAT、Bcl-2/Bax mRNA表达明显降低,Caspase-3与FoxO1 mRNA表达明显增加(P＜0.05);与模型组比较,BBR干预后KGN细胞CAT与Bcl-2/Bax mRNA表达明显增加(P＜0.05),Caspase-3与FoxO 1 mRNA表达较模型组明显降低(P＜0.05).Western blot结果显示,与空白组比较,模型组SIRT1、SOD2及p62蛋白水平显著降低(P＜0.01),JNK、FoxO1、LC3B Ⅱ与Beclin-1蛋白水平明显升高(P＜0.05);BBR干预后,SIRT1、SOD2及p62蛋白水平较模型组显著增加(P＜0.01),JNK、FoxO1、LC3BⅡ与Beclin-1蛋白水平较模型组明显降低(P＜0.05).结论:BBR具有抑制卵巢颗粒细胞衰老效应,其机制与通过SIRT1/FoxO1通路介导抑制细胞凋亡与自噬有关.