m6 A去甲基化酶ALKBH5对大鼠S1PR3基因3'-非编码区双荧光素酶活性的影响

[目的]明确m6A去甲基化酶ALKBH5对含S1PR3基因3'-非编码区(3'-UTR)双荧光素酶报告基因的调控作用.[方法]以大鼠前额叶皮层脑区cDNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增S1PR3基因3'-UTR中含有m6A修饰位点的目的片段.利用重叠延伸PCR方法将三个靶序列GGACT、GGACT、AGACT中的第三位A突变为C,并将野生型S1PR3-3'-UTR片段和突变型S1PR3-mut-3'-UTR片段分别正向插入到pmiR-RB-Report?vector载体中.将pcDNA3.1-ALKBH5或空载体pcDNA3.1与野生型和突变型双荧光素酶报告载体分别共转染PC12细胞,并检测荧光素酶活性.[结果]成功构建了包含S1PR3基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-3'-UTR和突变型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-mut-3'-UTR.荧光素酶活性分析表明与空载体pcDNA3.1组相比,ALKBH5可显著降低野生型及突变型C1和C2报告载体荧光素酶的活性(P＜0.05),而对突变型C3没有影响(P＞0.05).[结论]初步证明S1PR3基因3'-UTR区是去甲基化酶ALKBH5的作用靶点,ALKBH5通过识别S1PR3基因3'-UTR区C3处的m6A修饰位点而降低pmiR-S1PR3-3'-UTR荧光素酶的活性.