三叶崖爬藤肉桂酸-4-羟化酶的生物信息学及体外功能研究

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)是苯丙烷代谢途径的关键酶之一,在植物黄酮类物质的合成代谢过程中发挥着重要的作用.在受到低温胁迫时中药材三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum)中具有药用价值的黄酮类物质总含量上升,但其机制尚不清楚.本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析低温胁迫下三叶崖爬藤C4H(ThC4H)基因表达量上升的现象,并利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得ThC4H基因的cDNA全长,随后在酿酒酵母中重组表达,检测其体外活性,并进行三维结构比对和底物分子对接研究.结果表明:该cDNA具有完整的开放阅读框1518 bp,编码505个氨基酸.ThC4H具有C4H家族保守的P450结构域,与花叶地锦(Parthenocissus henryana)的C4H有91.88％的相似性.重组ThC4H蛋白具有体外催化反式肉桂酸生成4-香豆酸的能力.ThC4H、苔藓植物C4H和高粱(Sorghum bicolor)C4H(SbC4H1)与肉桂酸对接位置及形成的氢键基本一致,猜测其催化机制相似,而导致不同C4H酶性质差异的可能原因是2号环(loop)区域和血红素结合域中2个氨基酸的多样性.本研究为进一步探索三叶崖爬藤ThC4H蛋白在抗寒方面的功能提供参考.