阳离子脂质肽用于单纯型大疱性表皮松解症基因治疗的初步评价

目的 合成两亲性阳离子脂质肽(RLS),通过报告绿色荧光蛋白基因(pEGFP)及治疗基因野生型角蛋白14(KRT14)的表达水平检测,考察其在小鼠成纤维细胞L929、小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3和人永生化角质形成细胞HACAT中的基因递送效率.方法 利用1HNMR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱表征RLS的化学结构.采用溶剂注入法制备RLS自组装体,检测其与基因复合前后的粒径、电位.将RLS自组装体与pEGFP静电吸附形成的基因复合物转染至L929、NIH-3T3、HACAT,利用EGFP表达平均荧光强度(MFI)半定量法评估复合物的转染效率,并在转染48 h后,采用CCK-8试剂法考察复合物对以上3种细胞的毒性.实时荧光定量PCR(q-PCR)检测KRT14 mRNA的表达水平.结果 成功制备了粒径为142.8±0.9 nm,Zeta电位为28.7±0.4 mV的RLS自组装体.将其与DNA复合后,粒径增至167.1±2.3 nm,Zeta电位降至20.2±0.5 mV.RLS基因复合物在3种细胞中均未显示明显毒性.在转染L929、NIH-3T3和HACAT细胞后,RLS组的pEGFP的平均荧光强度分别为96、46、33.q-PCR结果显示:在L929、NIH-3T3、HACAT细胞中,RLS组KRT 14 mRNA的表达水平分别约是Lipo2000的130、100和5倍,是PEI的1.7×105、120、5倍,证明了阳离子脂质肽具有高的基因递送效率.结论 RLS作为一种高效、安全的基因递送载体.在由KRT14基因突变引起的单纯型大疱性表皮松解症遗传性皮肤疾病中,具有一定的应用潜力.