质粒DNA实验室规模化制备工艺

目的 探索实验室规模生产质粒DNA(plasmid DNA,pDNA)的制备工艺.方法 选用质粒pEGFP-N1 E.coli Stbl3菌株,用最陡爬坡试验(plackett-burman,PB)筛选出影响质粒产量最显著因素,响应面法优化重组菌高产发酵条件.采用碱裂解,浓缩质粒,通过凝胶、亲和、离子等层析分离纯化pDNA,并对所纯化的pDNA进行质量评价.结果 用PB试验和响应面试验设计筛选出的关键因素是:酵母提取物20 g/L,甘油6 g/L,接种物浓度吸光度(optical density,OD)=0.014.在最佳条件下进行3次平行发酵,生物量OD 600达28.07±2.01,质粒产量(21.34±1.31)mg/L.pDNA纯度(A260 nm/A280 nm)为1.91±0.02.内毒素含量小于0.005 EU/g DNA;几乎检测不到蛋白质及细菌基因组DNA残留,达到相关质量标准.结论 本研究采用的制备工艺可生产出高质量的pDNA.