RNA甲基化转移酶METTL3对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

[目的]探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖和成肌分化的影响.[方法]利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异.设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况.将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因子肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)、肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的表达情况.通过比色法检测干扰或过表达METTL3后,BSMSCs不同时期的m6A RNA甲基化水平.[结果]BSMSCs分化后METTL3蛋白表达水平极显著高于增殖期(P＜0.01);干扰或过表达METTL3后,Pax7的mRNA水平以及蛋白水平均无显著变化(P＞0.05),EdU阳性细胞率与对照组相比均无显著差异(P＞0.05);干扰METTL3后,细胞肌管数量明显增多,肌管直径明显增大,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m6A RNA甲基化水平均极显著下调(P＜0.01);过表达METTL3后,细胞肌管数量明显减少,肌管直径明显变小,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m6A RNA甲基化水平均极显著上升(P＜0.01).[结论]METTL3对BSMSCs的增殖过程没有显著影响,但对BSMSCs的成肌分化过程具有调控作用,并影响BSMSCs的m6A RNA甲基化水平.干扰METTL3可以促进BSMSCs的成肌分化进程,降低BSMSCs的m6A RNA甲基化水平;而过表达METTL3会抑制BSMSCs的分化,提高BSMSCs的m6A RNA甲基化水平.试验结果为进一步探明METTL3在牛肌肉发育中的调控机制奠定了基础.