pcDNA3/HA-moesinT558A和pcDNA3/HA-moesinT558D基因突变体构建与验证

目的 构建抑制型pcDNA3/HA-moesinT558A与激活型pcDNA3/HA-moesinT558D基因突变体,并在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中验证.方法 设计特定的moesinT558A、moesinT558D基因突变引物,以pcDNA3/HA-moesin为模板,采用逆向PCR技术进行体外定点突变,以丙氨酸、天冬氨酸取代苏氨酸,获得抑制型pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型pcDNA3/HA-moesinT558D基因突变体并测序.体外培养HUVECs,随机分为对照1组、pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组以及对照2组、pcDNA3/HA-moesinT558A组、pcDNA3/HA-moesinT558D组,pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesinT558A组、pcDNA3/HA-moesinT558D组分别转染pcDNA3/HA空载体、pcDNA3/HA-moesin、pcDNA3/HA-moesinT558A、pcDNA3/HA-moesinT558D,对照1组与对照2组不予转染.转染24 h,收集细胞,采用实时荧光定量PCR法检测moesin mRNA表达,采用Western blotting法和免疫荧光法检测moesin蛋白表达.结果 经测序,目的基因moesinT558A、moesinT558D序列完全正确,第558位苏氨酸分别突变为丙氨酸、天冬氨酸,抑制型pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型pcDNA3/HA-moesinT558D基因突变体构建成功.pcDNA3/HA-moesin组moesin mRNA相对表达量显著高于对照1组和pcDNA3/HA空载体组(t分别为16.688、16.649,P均<0.05),而pcDNA3/HA空载体组与对照1组比较差异无统计学意义(t=1.925,P>0.05).pcDNA3/HA-moesinT558D组、pcDNA3/HA-moesinT558A组moesin mRNA相对表达量均显著高于对照2组(t分别为13.809、9.260,P均<0.05),pcDNA3/HA-moesinT558D组与pcDNA3/HA-moesinT558A组比较差异无统计学意义(t=2.364,P>0.05).Western blotting结果显示,pcDNA3/HA-moesinT558A组和pcDNA3/HA-moesinT558D组均能观察到HA-moesin蛋白表达,而对照1组未观察到HA-moesin蛋白表达.免疫荧光结果显示,pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesinT558A组和pcDNA3/HA-moesinT558D组均能观察到HA-moesin荧光,而对照2组未观察到HA-moesin荧光.结论 成功构建了抑制型pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型pcDNA3/HA-moesinT558D基因突变体;经验证,这两种基因突变体均能促进moesin表达.