水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(gE)的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证.方法 以VZV全病毒抗原为免疫原,通过小鼠杂交瘤融合技术筛选可稳定分泌抗VZV-gE抗体的杂交瘤细胞株,间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价,经HiTrapTM MabselectTMSuRe 和 HiTrapTM Desalting纯化后,12％SDS-PAGE分析单克隆抗体纯度,Western blot法检测特异性,小鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定亚型.经表位叠加试验筛选捕获抗体及酶标抗体,棋盘滴定法确定捕获抗体(0.25、0.5、1、2、5和10μg/mL)和酶标抗体(1∶500、1∶1 000、1∶2000、1∶5000和1∶10000稀释)工作浓度后,建立VZV-gE含量的双抗体夹心ELISA检测方法.验证方法的线性范围、准确性、精密性和特异性.采用建立的方法检测3批7 L生物反应器培养1-14 d的CHO-VZV-gE细胞培养上清中gE含量.结果 共获得4株稳定分泌抗VZV-gE特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株,命名为mAb-B2、mAb-11、K9C7和K9F4,小鼠腹水抗体效价为106～107,纯化后纯度约为97％,均可与VZV全病毒蛋白发生特异性结合,轻链均为κ链,重链分别为IgG2b、IgG1、IgG2b及IgG2a.确定mAb-B2作为捕获抗体,HPR标记的mAb-11作为酶标抗体,两者最佳工作浓度分别为1.5 μg/mL和1:5 000稀释.gE抗原内部参考品浓度在1.95～1 000 ng/mL范围内,与A450呈良好的线性关系,四参数方程为:Y=(0.15～3.99)/[1+(X/67.4)1.49]+3.99,R2为0.999;准确性验证回收率为94.9％～114.0％;精密性验证变异系数(CV)均＜15％;除CHO-VZV-gE细胞培养上清、水痘减毒活疫苗和带状疱疹减毒活疫苗外,其他检测样品的A450均＜0.15,无交叉反应.3批CHO-VZV-gE细胞培养上清中gE含量随培养时间的延长逐渐升高,且在14 d内与培养时间呈正相关(R2=0.995 6,P=0.000 1).结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的准确性、精密性和特异性,可用于VZV疫苗中gE抗原含量的快速检测.