白念珠菌诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞焦亡的初步研究

目的 探讨白念珠菌对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)焦亡的影响.方法 通过活细胞工作站实时观察白念珠菌[感染复数(MOI)=50,下同]体外诱导BMDM后是否发生焦亡;将BMDM分为对照组、白念珠菌组,分别用磷酸盐缓冲液和白念珠菌酵母诱导BMDM 6 h,实时荧光定量PCR检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18 mRNA表达水平,Western印迹法检测NLRP3、胱天蛋白酶1(Caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)的表达及剪切水平.用白念珠菌诱导BMDM不同时间(0、10、15、20及25h)后,酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-18分泌水平.白念珠菌体外诱导野生型(WT)BMDM及GSDMD敲除(KO)BMDM 15 min,采用流式细胞仪比较WT、GSDMD KO BMDM对白念珠菌的吞噬率;诱导6h后,采用流式细胞仪及乳酸脱氢酶(LDH)释放法分别检测WT、GSDMD KO BMDM的死亡率.分别设置空白对照组、对照组、样品最大酶活性对照孔组、IL-1 β组、白念珠菌组、IL-1β+白念珠菌组,用IL-1β和/或白念珠菌酵母诱导BMDM后用LDH释放法分析WT及GSDMD KO BMDM死亡率.采用非配对t检验、Kruskal-Wallis检验、方差分析等统计学方法进行统计分析.结果 白念珠菌体外诱导BMDM后细胞可出现气球样变及出泡现象,证实焦亡发生;与对照组相比,白念珠菌组诱导BMDM 6 h后NLRP3、IL-1β的mRNA表达水平明显升高(t=13.02、17.51,P=或＜0.001),而IL-18mRNA表达水平无明显变化(P=0.486),且白念珠菌诱导可引起炎症小体NLRP3表达增多及Caspase-1、GSDMD剪切.白念珠菌诱导BMDM不同时间(0、10、15、20及25 h)后IL-1β的分泌水平随时间逐渐升高(H=12.90,P=0.012),而IL-18的分泌水平无明显变化(F=0.48,P=0.753),且GSDMD KO组BMDM的IL-1β分泌水平低于WT BMDM组(F=24.22,P=0.008).白念珠菌体外诱导 15 min后,GSDMD KO BMDM[(50.3±1.10)％]对白念珠菌的吞噬率低于WT BMDM[(58.53±1.19)％,t=5.09,P=0.007];白念珠菌体外诱导6 h后,流式细胞仪检测显示GSDMD KO组BMDM的死亡率(38.40％±0.50％)高于WT组BMDM(34.37％±0.52％),t=4.72,P=0.009;LDH 检测同样显示 GSDMD KO BMDM 的死亡率(22.52％±0.18％)高于WT BMDM(12.48％±0.15％),t=42.36,P＜0.001;IL-1β 预处理后予白念珠菌体外诱导的 WT BMDM及GSDMD KO BMDM的细胞死亡率均较单纯白念珠菌诱导组降低(均P＜0.001).结论 白念珠菌可诱导BMDM发生焦亡,焦亡的发生可促进IL-1β释放,并通过提高巨噬细胞的免疫活性,降低巨噬细胞死亡率.