山葡萄转录因子VaMYB4a互作蛋白的筛选与鉴定

以抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)'左山-1'叶片组织为试材,通过Gateway技术构建酵母均一化cDNA文库,库容量为1.36×107cfu·mL-1,外源基因插入片段均大于1 kb,重组率为100％,符合后续试验要求.以VaMYB4a113-252 C端调控区段为诱饵,经酵母双杂交筛选获得17个候选互作蛋白,选取2个与非生物胁迫应答密切相关的候选互作蛋白分别在酵母、拟南芥原生质体中进行互作验证,发现锌指类转录因子VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a113-252存在互作关系.经系统进化与蛋白保守结构域分析,推测葡萄COL基因家族中VaCOL2与VaMYB4a具有潜在互作关系,进而通过BiFC验证表明,VaCOL2与VaMYB4发生蛋白互作;顺式作用元件预测表明VvCOL2、VvCOL4与VvCOL5启动子区包含多个激素及逆境应答相关元件,其中VvCOL2包括多个低温响应元件(LTRE);低温胁迫下,VaMYB4a、VaCOL4与VaCOL5具有相同的表达模式,但VaCOL2表达模式不同.综上,VaMYB4a可与VaCOL2、VaCOL4及VaCOL5互作形成蛋白复合体以协同或拮抗的方式调控植物低温胁迫应答.