东京四照花盐胁迫响应下实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

利用实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)分析基因的表达时,内参基因的选择对保证研究结果的准确性至关重要.本研究以东京四照花(Cornus hongkongensis subsp.tonkinensis)经过不同盐胁迫时间的根与叶为材料,基于转录组数据,选择9个候选内参基因:18S核糖体RNA(18S ribosome RNA,18S rRNA)、翻译起始因子2(initiation factor 2,IF2)、转录延伸因子1(elongation factor-1α1,EF-1-α1)、EF-1-α2、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APT)、亲环蛋白1(cycloidea1,cyc1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、GAPDH2和β微管蛋白(β-tubulin,TUB)基因进行qRT-PCR扩增.运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件对9个候选内参基因进行表达稳定性分析,最后用RefFinder程序综合分析、得出最适的内参基因,并利用目的基因超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)基因进行验证.实验结果表明,18S rRNA和GAPDH为盐胁迫下东京四照花各组织中表达最稳定的基因,EF-1-α2是最不稳定的基因.但18S rRNA的Ct值较高,意味着18S rRNA在各个组织中的表达量比GAPDH低.验证结果也表明以GAPDH为内参基因时,目的基因相对表达量与转录组测序结果较为一致.因此认为GAPDH为盐胁迫下东京四照花荧光定量PCR基因分析的最适内参基因.本研究可为后期研究东京四照花相关耐盐基因表达及功能提供参考.