马铃薯晚疫病菌对甲霜灵抗性的快速检测方法

为快速检测马铃薯晚疫病菌——致病疫霉Phytophthora inffestans对甲霜灵的抗性,基于已知致病疫霉RPA190基因的T1145A变异引起的F382Y氨基酸点突变与甲霜灵抗性有关,通过设计4对特异性引物 F382Y-F1/F382Y-R、F382Y-F2/F382Y-R、F382Y-F3/F382Y-R 和 F382Y-F4/F382Y-R 建立等位基因特异性 PCR(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR)快速分子检测法,其中F382Y-R引物在4对引物里保持不变,并分析所建分子检测法的特异性和灵敏度.结果表明,正向特异性引物F382Y-F2、F382Y-F3和F382Y-F4的3'末端在致病疫霉抗甲霜灵菌株原有核苷酸突变位点1145A(对应引物为F382Y-F1)的基础上,再人工引入第1 144位的核苷酸突变,将1144T分别突变成1144G、1144C和1144A,并优化退火温度和特异性引物与内参引物ITS1/ITS4比例,最终确定最适退火温度分别为54、60和58℃,特异性引物与内参引物最适浓度比例均为5∶1.以该3条引物对应的3对特异性引物和内参引物ITS1/ITS4组成的3组多重AS-PCR引物对甲霜灵敏感和抗性菌株具有良好的特异性,敏感菌株的扩增产物含1条879 bp的内参片段,抗性菌株的扩增产物为1条879 bp的内参片段和1条461bp的目的片段.3组AS-PCR检测体系均具有较高的灵敏度,其中引物F382Y-F4/F382Y-R对致病疫霉DNA的检测灵敏度达0.4 pg/μL,引物F382Y-F2/F382Y-R和F382Y-F3/F382Y-R的检测灵敏度达4 pg/μL.