上调钙敏感受体对大鼠多孔钽-BMSCs复合培养成骨向分化的影响及其作用机制

目的 探讨上调钙敏感受体(CaSR)对大鼠多孔钽-骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合培养成骨向分化的影响及其作用机制.方法 提取SD大鼠BMSCs培养至第3代,通过成骨向和成软骨向诱导后,采用茜素红染色和甲苯胺蓝染色鉴定;荧光显微镜观察BMSCs在多孔钽表面的生长黏附情况;CCK-8法检测BMSCs在不同浓度(200、250、300、350、400 μmol/L)GdCl3(CaSR激动剂)处理下培养1～5 d的细胞增殖情况,选取最适作用浓度;激光共聚焦显微镜观察激活CaSR后细胞内钙离子分布情况.取第3代BMSCs成骨诱导并分为对照组(加入成骨诱导培养基)、GdCl3组(加入含300 μmol/L GdCl3的成骨诱导培养基)、多孔钽组(与国产多孔钽材料复合培养,加入成骨诱导培养基)与GdCl3+多孔钽组(与国产多孔钽材料复合培养,加入含300 μmol/L GdCl3的成骨诱导培养基).培养第7天,检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性;培养第7、14、21天,采用ELISA法检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)分泌水平,Western blotting检测ColⅠ、OPN、Runt相关转录因子2(Runx2)、Homer 1蛋白的表达.结果 茜素红、甲苯胺蓝染色结果显示分离提取的细胞为BMSCs;CCK-8法检测结果显示,300 μmol/L GdCl3处理的细胞活性最高(P<0.05);激光共聚焦显微镜观察显示,激活CaSR后细胞内钙离子荧光强度明显增高(P<0.05).GdCl3组、多孔钽组和GdCl3+多孔钽组培养第7天ALP活性以及第7、14、21天的ColⅠ、OPN、Runx2、Homer1蛋白相对表达量均高于对照组(P<0.05);GdCl3+多孔钽组培养第7天的ALP活性以及ColⅠ、Runx2、Homer1蛋白相对表达量高于GdCl3组、多孔钽组,第14天的ColⅠ、OPN、Runx2、Homer1蛋白相对表达量高于GdCl3组,第21天的ColⅠ、OPN、Runx2、Homer1蛋白相对表达量高于多孔钽组,第7、14、21天的ColⅠ与第7、21天的OPN蛋白分泌量明显高于GdCl3组、多孔钽组和对照组(P<0.05);多孔钽组培养第7天的ColⅠ与第21天的OPN蛋白分泌量高于对照组(P<0.05);GdCl3组培养第21天的ColⅠ与第14天的OPN蛋白分泌量高于对照组(P<0.05).结论 多孔钽与BMSCs复合培养后,上调CaSR可促进细胞成骨向分化,其机制可能与激活ColⅠ、Runx2、OPN等成骨基因的表达有关.