菠萝PARMS反应体系的建立

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)广泛分布在植物的基因组中,具有丰富的DNA变异形式.基于单核苷酸多态性开发的标记被认为是极具应用前景的分子标记.五引物扩增受阻突变体系(Penta-primer amplification re-fractory mutation system,PARMS)是一种基于单核苷酸多态性的新型基因分型技术,具有通量高、准确性高、成本低和耗时短等优点.因此,建立高效、简便可行的PARMS分型技术对菠萝种质资源的鉴定、基因定位的开展以及分子辅助选择育种体系的建立具有重要意义.本研究以3份表型差异显著的菠萝种质资源为材料,基于130份菠萝种质资源的重测序数据分析结果,设计特异引物SNP31.结果显示,SNP31可将菠萝种质资源进行较好地分型,可用于后续反应体系的优化.为了建立适用于菠萝的PARMS-SNP分型体系,对PARMS的反应体积、引物浓度、DNA的提取方法和DNA浓度等参数进行优化.研究结果表明,反应体积、引物浓度以及DNA的浓度均能影响基因型信号点的荧光信号值.在较大或较小的反应体积下基因型信号点的荧光信号值均降低,最适的反应体积为6μL.随着引物和DNA浓度的增加,基因型信号点的荧光信号值增加,最佳的引物和DNA浓度分别为100μmol/L和25 ng/μL.此外,不同基因组DNA的提取方法均能对3份种质实现较好的PARMS-SNP分型.因此,PARMS-SNP分型体系的最佳反应体系为:反应总体积6μL,DNA(25 ng)1μL,PARMS mix 3μL,Primer mix(100μmol/L)0.45μL,ddH2O 1.55μL.利用65份菠萝种质资源验证该体系的准确性和稳定性,获得了较好的PARMS-SNP分型结果.本研究建立的PARMS-SNP分型体系为开展菠萝种质资源遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因定位及分子标记辅助选择提供基础.