牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重qPCR方法的建立

为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率,以牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.m)ompH基因、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolyt-ica,M.h)gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)以及牛副流感病毒(bovine parainfluenza virus type,BPIV)3型a和c基因型(BPIV-3a,-3c)的N基因等为检测靶标,分别设计特异性引物和Taqman探针,通过优化反应条件,采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法.结果显示,该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应,与其他常见病原无交叉反应.对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为102、102、101、102、102、102和101 拷贝/μL.组内变异系数小于2.5％,组间变异系数小于5.5％.平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测,P.m阳性率36.65％,M.b阳性率27.83％,M.h阳性率25.22％,IBRV阳性率11.30％,BPIV-3c阳性率8.57％,BRSV阳性率0.95％;其中混合感染率为26.1％.共检测到11种混合感染模式,主要由M.b与其他病原体的混合感染,占72.7％(8/11);M.b/P.m混合感染的检出率最高,占60％(18/30);M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三,其占比分别为73.3％(22/30)、73.3％(22/30)和43.3％(13/30);其次为IBRV,占26.7％(8/30);BPIV-3c 占13.3％(4/30).以上结果表明,该方法具有较高的分析敏感性和特异性,可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测.