巨噬细胞迁移抑制因子促进人胚胎干细胞分化为腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞

背景:细胞替代疗法是一种可以治疗帕金森病的非常有前景的方法.目前将人多能干细胞进行神经分化的主要方案是"双SMAD"抑制方案,利用阻断糖原合酶激酶3β来激活WNT通路信号,随后利用音猬因子信号与骨形态发生蛋白信号之间的调控相结合,可以精确地控制人多能干细胞从底板区域到顶板区域特异性的细胞命运.巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一类具有独特结构的多效免疫调节细胞因子,在多项研究中证明MIF对神经发育和分化非常重要.然而,MIF是否参与诱导干细胞的分化还是未知的.目的:在"双SMAD"抑制分化方案的基础上,通过在培养基中添加不同浓度MIF及其抑制剂(S,R)-3-(4-羟基苯基)-4,5-二氢-5-异噻唑乙酸甲酯(ISO-1),观察其对人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞的影响,以期寻找解决人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞过程异质性问题的新途径.方法:CCK8检测添加不同浓度MIF和ISO-1培养人胚胎干细胞的存活情况.免疫荧光法检测人胚胎干细胞上MIF受体CD74、CD44、CXCR7的表达.在胚胎干细胞分化16 d后,通过RT-qPCR和Western blot分别检测腹侧中脑标志物LMX1A、FOXA2、EN1、前脑标记物FOXG1、后脑标记物HOXA2、中脑基板标记物PAX6和Wnt1/β-catenin信号通路转录因子SOX6的表达水平.同时,通过免疫荧光法检测LMX1A、FOXA2、EN1、MAP2的表达.将胚胎干细胞继续分化到42 d后用免疫荧光法检测LMX1A、FOXA2、TH和GIRK2在多巴胺能神经元中的表达.结果 与结论:①MIF在人胚胎干细胞内表达,其相关受体CD44和CXCR7也表达,但CD74不发生表达;②添加MIF后,促进了LMX1、FOXA2、EN1的蛋白表达,促进了LMX1、FOXA2的基因表达,同时明显抑制了FOXG1和HOXA2以及PAX6的基因与蛋白表达,有效抑制了分化的异质性;③添加MIF后,多巴胺能神经祖细胞中SOX6并未如预期那样高表达,反而在基因层面表达下降,而其抑制剂ISO-1则使SOX6表达在基因水平上轻度升高;④该研究证明了MIF在人胚胎干细胞的多巴胺能分化潜能与腹侧中脑命运决定中起着重要作用,MIF的干预进一步优化了神经诱导的区域定位.