柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬

背景:自噬在肝纤维化中发挥重要作用,可以通过诱导肝星状细胞活化促进肝纤维化的进程.前期研究表明,柔肝降酶方具有保护肝功能、抗炎、抗氧化应激反应等作用,其是否通过自噬抗肝纤维化的作用机制尚未阐明.目的:探讨柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞活化及自噬的影响及其潜在的作用机制.方法:用脂多糖建立人肝星状细胞活化模型,分成不同的处理组:①空白组:人肝星状细胞+空白血清;②模型组:人肝星状细胞+空白血清+脂多糖;③柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组:人肝星状细胞+低、中、高剂量柔肝降酶方含药血清+脂多糖;④柔肝降酶方高剂量含药血清联合雷帕霉素组:高剂量组基础上+雷帕霉素;⑤柔肝降酶方高剂量含药血清联合PI3K抑制剂组:高剂量组基础上+LY294002.CCK-8法观察细胞增殖情况;采用单丹磺酰尸胺染色法观察细胞自噬情况;Western Blot检测细胞通路蛋白(PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR)、自噬相关蛋白(P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)、人肝星状细胞活化标志蛋白(α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原纤维)表达水平的影响.结果 与结论:①柔肝降酶方含药血清能够降低人肝星状细胞的增殖活性,下调Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达,上调自噬P62蛋白的表达,降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达,且呈现剂量依赖性;②MDC荧光染色结果显示,柔肝降酶方含药血清可使细胞绿色斑点荧光强度降低;③加入自噬激动剂雷帕霉素后,P62蛋白表达降低,LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达升高;④经过柔肝降酶方含药血清处理后,PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平升高,呈剂量依赖性,这种作用能被PI3K抑制剂LY294002减弱;⑤提示柔肝降酶方含药血清可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬,减少脂多糖诱导的人肝星状细胞活化.