水解南珠液通过Wnt/β-catenin通路调节细胞自噬对人微血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

目的:以人微血管内皮细胞（HMEC-1）为研究对象，采用H2O2诱导人微血管内皮细胞氧化应激损伤，探讨水解南珠液调节细胞自噬从而抑制氧化应激损伤的机制。方法:采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法和活性氧荧光探针（DCFH-DA）法建立人微血管内皮细胞氧化应激损伤模型。采用Western blot法检测氧化应激损伤模型细胞自噬情况和Wnt/β-catenin通路变化情况。水解南珠液作用后，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测Wnt信号通路关键蛋白Wnt3a和β-catenin基因的mRNA水平和透射电镜观察细胞自噬小体含量。通过Western blot法检测不同时间点Wnt3a、β-catenin和LC3-Ⅱ蛋白表达的时序性改变。采用WST-1法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶活性；采用硝酸还原酶法测定细胞NO分泌量。最后采用TUNEL法检测水解南珠液对氧化应激损伤细胞凋亡情况的影响。结果:使用200 μmol/L浓度的H2O2作用HMEC-1 6 h，成功建立了内皮细胞氧化应激损伤模型。与对照组相比，氧化应激损伤组细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达上扬，但Wnt3a和β-catenin蛋白表达却下降（均P＜0.05）。经透射电镜观察，氧化应激损伤组细胞内还可见较多明显的双层膜结构的自噬小体。水解南珠液处理后，随着作用时间延长，细胞内自噬小体的含量越来越少且Wnt3a和β-catenin mRNA表达水平越来越高（均P＜0.05）。且在Wnt3a和β-catenin呈时序性表达上扬的同时，LC3-Ⅱ蛋白表达则呈相对应的时序性减少。经水解南珠液处理后，细胞SOD活性与氧化应激损伤组相比，呈显著增加趋势。水解南珠液组细胞NO分泌量为（121.78±0.17）μmol/L，明显高于氧化应激损伤组的（70.43±0.74）μmol/L（P＜0.05）。氧化应激损伤组的TUNEL阳性细胞为20.3±2.8，水解南珠液作用组则减少为10.4±2.3（P＜0.05）。结论:水解南珠液能促进氧化损伤HMEC-1细胞的SOD活性、NO分泌和减少氧化损伤引起的细胞凋亡率，从而抑制氧化应激损伤程度，这些作用与水解南珠液能激活Wnt/β-catenin信号通路从而减轻细胞自噬有关。