miR-135a/b靶向SIRT1调控葡萄膜黑色素瘤细胞的迁移

目的：:研究microRNA-135a/b（miR-135a/b）对葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞迁移能力的调控作用及其机制。方法：:实验研究。采用定量RT-PCR检测UM标本和癌旁组织中miR-135a/b的表达水平。将miRNA模拟物转染入UM细胞（M23和SP6.5）过表达miR-135a/b，转染无义序列作为对照组（NC）。利用小RNA干扰技术和慢病毒过表达载体感染技术分别下调和上调细胞中SIRT1蛋白表达水平，分别以无义小干扰RNA（siNC）和插入无义序列的慢病毒载体（Lv-NC）作为阴性对照。采用划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力。双萤光素酶报告实验用于鉴定miR-135a/b的靶基因。Western blot检测SIRT1蛋白的表达水平。采用独立样本 t检验进行数据分析。 结果：:定量RT-PCR结果显示miR-135a/b在UM组织较癌旁组织的表达水平明显下调（miR-135a： t=6.38， P=0.003；miR-135b： t=23.26， P<0.001）。划痕实验和Transwell实验结果显示，与NC组相比，miR-135a/b过表达M23和SP6.5细胞迁移距离减小（miR-135a： t=36.01、8.98，均 P<0.01；miR-135b： t=27.53、10.51，均 P<0.01）且迁移细胞数量减少（miR-135a： t=7.04、7.02，均 P<0.01；miR-135b： t=5.01、7.32，均 P<0.01）。双萤光素酶实验证实，miR-135a/b能够明显抑制SIRT1野生组萤光素酶的荧光值（miR-135a： t=2.88， P=0.028；miR-135b： t=4.99， P=0.003）；Western blot结果表明，与NC组相比，过表达miR-135a/b的M23和SP6.5细胞中SIRT1的蛋白水平下调（miR-135a： t=9.93、4.13，均 P<0.01；miR-135b： t=4.66、6.20，均 P<0.01）。siSIRT1转染后划痕实验和Transwell实验结果显示，与siRNC组相比，M23和SP6.5细胞中下调SIRT1蛋白水平后细胞的迁移距离减小（siSIRT1-I： t=13.88、11.78，均 P<0.01；siSIRT1-II： t=31.20、6.27，均 P<0.01）且迁移细胞数量减少（siSIRT1-I： t=7.57、4.66，均 P<0.01；siSIRT1-II： t=5.58、3.25，均 P<0.05）。M23和SP6.5细胞中上调SIRT1蛋白水平同时过表达miR-135a/b，Transwell实验结果显示，细胞的迁移数量较仅过表达miR-135a/b升高（miR-135a+Lv-SIRT1： t=4.10、2.75，均 P<0.05；miR-135b+Lv-SIRT1： t=2.99、2.49，均 P<0.05）。 结论：:miR-135a/b在UM中明显下调且通过靶向结合SIRT1 mRNA 3'非翻译区抑制UM细胞的迁移，提示miR-135a/b-SIRT1信号轴在UM发展中发挥重要作用。