非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

[目的]试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟.[方法]将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24-145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定.利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性.以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测.[结果]ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具有良好的免疫原性,小鼠血清抗体效价为1 ∶12 800.本研究建立的ELISA方法(p22-ELISA)的最佳抗原包被浓度为0.125 μg/孔,最佳待检血清稀释度为1 ∶800,最佳酶标二抗稀释度为1 ∶10 000;阴阳性临界值为0.384;与CSFV、PRRSV、PCV2、PRV等抗体阳性猪血清无交叉反应,说明特异性好;批内与批间变异系数均低于10％,表明重复性好.利用p22-ELISA方法检测了 263份临床猪血清样品,与商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒的符合率为97.7％.[结论]本研究基于原核表达的p22截短体蛋白建立了用于检测ASFV抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ASFV感染诊断和流行病学调查提供了技术支撑.