蒙古马胎儿成纤维细胞永生化细胞体系建立的研究

[目的]试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞(equine fetal fibroblasts,EFFs)系,为马繁殖与发育生物学研究提供参考.[方法]采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs,利用表达人端粒酶逆转录亚基(hTERT)和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染EFFs,经潮霉素B筛选得到阳性细胞hTERT-EFFs,以第3代EFFs为对照,采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平,CCK-8法绘制生长曲线检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况.使用DNAMAN软件比对分析人、马、小鼠、牛、绵羊、猪多物种TERT核苷酸、蛋白和端粒酶RNA组分(TERC)序列相似性.[结果]原代EFFs在实验室培养体系下可传至17代,但第17代细胞发生了衰老.hTERT基因可成功转入EFFs,并至少稳定表达20代.然而hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs(P＜0.05),hTERT-EFFs凋亡早期细胞率显著高于EFFs(P＜0.05).细胞衰老检测结果表明,hTERT-EFFs β-半乳糖苷酶染色呈阳性.序列相似性比对结果显示,马TERT与hTERT mRNA保守性较高,相似性为73.2％;马TERT与hTERT蛋白保守性较其他物种高,相似性为76.3％,表明马TERT与hTERT在结构和功能上是高度相似;马TERC与人TERC相似性较高,在进化树上位于同一分支,但马TERC与TERT的结合及与端粒酶活性相关的关键核苷酸中存在突变.[结论]单独过表达hTERT可以延长EFFs体外传代次数不超过30代,但仍不足以使蒙古马EFFs细胞高质量永生化,这可能与hTERT与eTERC不相容有关.