基于柔肝养筋理论研究肝外泌体减少膝骨关节炎软骨凋亡及木瓜的疗效机制

目的:研究衰老肝细胞外泌体对炎症软骨细胞的影响及木瓜的干预效应.方法:用0.3 mmol/L过氧化氢(H2O2)诱导肝细胞衰老,以木瓜煎剂冻干粉干预小鼠肝原代细胞,采用CCK8法检测细胞存活率,分组为正常组、衰老组、木瓜组,Western blot和qRT-PCR检测肝细胞衰老相关p16、p21、p53蛋白及基因表达;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH活性.超速离心法提取肝细胞分泌的外泌体,电镜、粒径分析、标志蛋白CD9、HSP70、TSG101鉴定外泌体.提取小鼠软骨细胞,LPS刺激以构建膝骨关节炎(KOA)炎症细胞模型,ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1 β(IL-1β)含量验证炎症模型.PKH67荧光检测外泌体摄取情况.将各组肝细胞外泌体干预LPS致炎软骨细胞,Western Blot和qRT-PCR检测凋亡相关Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白及基因表达水平.结果:外泌体呈椭圆形或圆形的囊泡样结构,直径约30～130nm.衰老组p16、p21、p53蛋白、基因及LDH含量表达显著高于正常组(P＜0.05),低于木瓜组(P＜0.05).软骨细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量均在LPS刺激后较刺激前升高(P＜0.05).木瓜组肝细胞外泌体干预抑制LPS诱导所致的促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表达水平的上升(P＜0.05),同时升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P＜0.05).结论:木瓜具有减缓肝细胞衰老及损伤的功能,衰老肝细胞外泌体加剧炎症软骨细胞凋亡,经木瓜干预的肝细胞外泌体可以减少软骨细胞凋亡,从而发挥保护软骨细胞的功效.