木薯普通花叶病毒侵染性克隆及GFP表达载体的构建与分析

木薯普通花叶病毒(Cassava common mosaic virus,CsCMV)(Potexvirus 属,Alphaflexiviridae 科)是新发现的一种潜在威胁木薯产业的病毒.本研究以前期在中国首次报道发现的CsCMV海南儋州Hainan-DZ分离物(CsCMV-HN)为基础,利用In-Fusion无缝克隆将CsCMV-HN全长cDNA片段克隆到植物表达载体pGreenⅡ-35S上,构建其全长cDNA侵染性克隆pCsCMV-HN.通过农杆菌介导法将侵染性克隆pCsCMV-HN注射接种本生烟,接种10 d后开始出现褪绿及叶皱缩等症状,经RT-PCR检测和病症观察统计,侵染效率达100％.在此基础上,采用90 bp重复的CP亚基因组启动子(subgenomic RNA promoter,SGP)策略构建其携带gfp报告基因的病毒表达载体pCsCMV-GFP,农杆菌注射接种本生烟7～10 d后,在紫外灯下可观察到非接种叶有较强的绿色荧光,RT-PCR检测和Western blot分析表明pCsCMV-GFP可在本生烟上系统性表达GFP.本研究成功构建的CsCMV侵染性克隆及GFP表达载体将为进一步研究该病毒基因功能及致病机制提供借鉴.