附子含药血清对脂多糖诱导的软骨细胞凋亡的影响及作用机制研究

目的:观察附子含药血清对脂多糖诱导的软骨细胞凋亡的影响,并从线粒体功能角度探讨其作用机制.方法:体外分离培养裸鼠膝关节软骨细胞,通过观察细胞形态和甲苯胺蓝染色进行软骨细胞鉴定.通过脂多糖诱导建立软骨细胞退变模型,并采用实时荧光PCR法测定软骨细胞中白细胞介素-6 mRNA、肿瘤坏死因子-αmRNA、基质金属蛋白酶-3 mRNA、基质金属蛋白酶-13 mRNA表达量进行模型鉴定.分别按照0.0012 mL·g-1、0.0024 mL·g-1、0.0048 mL·g-1体质量以制备的附子汤剂和0.9％生理盐水(1 mL)给SD大鼠灌胃,获取低、中、高剂量附子含药血清及空白血清,经CCK-8法检测含药血清细胞毒性,确定2％含药血清为最佳浓度.取培养的第3代软骨细胞,设置6组,附子低、中、高剂量组及空白血清组分别置于加入含1μg·mL-1脂多糖、2％含药血清、8％FBS的DMEM完全培养基中培养,脂多糖组置于含1μg·mL-1脂多糖的DMEM完全培养基中培养,对照组在DMEM完全培养基中培养,各组均干预24 h.干预结束后,检测各组软骨细胞中的ATP含量(荧光发光法)、Casepase-3 mRNA表达量(实时荧光PCR法)、Casepase-3蛋白表达量(Western Blot法)及细胞凋亡率(流式细胞术).结果:①软骨细胞中ATP含量.各组软骨细胞中ATP含量比较,差异有统计学意义(1.294±0.132,1.000±0.000,1.668±0.092,2.633±0.244,2.056±0.110,1.854±0.107,F=99.725,P=0.000).脂多糖组的ATP含量低于对照组和空白血清组(P=0.046,P=0.000);附子低、中剂量组的ATP含量均高于空白血清组(P=0.018,P=0.013),附子高剂量组与空白血清组ATP含量的差异无统计学意义(P=0.238);附子低剂量组的ATP含量高于附子高剂量组(P=0.031),附子中剂量组与附子低、高剂量组ATP含量的差异均无统计学意义(P=0.086,P=0.298).②软骨细胞中Casepase-3 mRNA和Casepase-3蛋白表达量.各组Casepase-3 mRNA表达量比较,差异有统计学意义(0.783±0.020,0.996±0.086,0.929±0.083,0.680±0.189,0.739±0.125,0.656±0.044,F=5.003,P=0.010).脂多糖组的Casepase-3 mRNA表达量高于对照组(P=0.030),脂多糖组与空白血清组Casepase-3 mRNA表达量的差异无统计学意义(P=0.455);附子低、中、高剂量组的Casepase-3 mRNA表达量均低于空白血清组(P=0.014,P=0.049,P=0.008);附子低剂量组与附子中、高剂量组Casepase-3 mRNA表达量的组间差异均无统计学意义(P=0.512,P=0.779),附子中、高剂量组Casepase-3 mRNA表达量的差异无统计学意义(P=0.355).各组Casepase-3蛋白表达量比较,差异有统计学意义(0.780±0.031,1.000±0.000,0.963±0.055,0.757±0.011,0.671±0.114,0.669±0.034,F=20.213,P=0.000).脂多糖组的Casepase-3蛋白表达量高于对照组(P=0.032),脂多糖组与空白血清组Casepase-3蛋白表达量的差异无统计学意义(P=0.455);附子低、中剂量组与空白血清组Casepase-3蛋白表达量的组间差异均无统计学意义(P=0.089,P=0.165),附子高剂量组的Casepase-3蛋白表达量低于空白血清组(P=0.019);附子低剂量组与附子中、高剂量组Casepase-3蛋白表达量的组间差异均无统计学意义(P=0.878,P=0.180),附子中、高剂量组Casepase-3蛋白表达量的差异无统计学意义(P=0.999).③软骨细胞凋亡率.各组软骨细胞凋亡率比较,差异有统计学意义[(6.460±0.806)％,(17.293±1.143)％,(15.413±0.145)％,(13.383±2.290)％,(11.023±1.950)％,(8.920±0.484)％,F=27.103,P=0.000].脂多糖组的细胞凋亡率高于对照组(P=0.000),脂多糖组与空白血清组细胞凋亡率的差异无统计学意义(P=0.115);附子低剂量组与空白血清组细胞凋亡率的差异无统计学意义(P=0.105),附子中、高剂量组的细胞凋亡率均低于空白血清组(P=0.003,P=0.000);附子低剂量组的细胞凋亡率高于附子高剂量组(P=0.030),附子中剂量组与附子低、高剂量组细胞凋亡率的组间差异均无统计学意义(P=0.076,P=0.100).结论:附子含药血清可以抑制脂多糖诱导的软骨细胞凋亡,这可能与其作用于线粒体依赖性Caspase-3信号通路有关.