基于低温沉积打印技术构建分级多孔脱细胞华通胶支架

目的 制备分级多孔的脱细胞华通胶支架,评价其生物相容性.方法 从临床上获得人脐带,并分离出华通胶组织,通过组织学染色观察其生物学成分.采用NaOH溶液对华通胶进行脱细胞处理,采用苏木精-伊红(HE)及DAPI染色观察脱细胞效果,扫描电镜评估脱细胞前后胶原保留情况.通过低温沉积3D打印技术制备分级多孔脱细胞华通胶支架,采用扫描电镜观察其内部微观结构.采用CCK-8实验检测分级多孔支架的细胞毒性.将第三代大鼠骨髓间充质干细胞接种于支架上,培养7 d后分别进行活/死染色和细胞鬼笔环肽微丝骨架染色观察.将第三代大鼠骨髓间充质干细胞接种于支架上,加入成软骨诱导培养基培养14 d后,通过qRT-PCR法检测成软骨分化相关基因(SOX9、ACAN、COLII、COLI)的表达水平.结果 ①人脐带呈条索状,由外层的羊膜、华通胶、两条脐动脉和一条脐静脉组成,分离出的华通胶为乳白色,呈胶状;②HE染色显示,华通胶富含细胞外基质;番红-O染色显示,华通胶富含糖胺多糖成分;天狼猩红染色显示,华通胶富含胶原成分;甲苯胺蓝染色显示,华通胶富含糖胺多糖成分;③经脱细胞处理好,华通胶色泽变得透明.HE及DAPI染色显示,脱细胞华通胶无细胞核结构;扫描电镜显示,脱细胞后,华通胶保留了很好的胶原成分;④通过低温沉积3D打印的支架,扫描电镜显示,支架内部呈现分级多孔的微观结构;⑤CCK-8细胞毒性实验显示,打印的支架无明显的细胞毒性;⑥活/死细胞染色显示,骨髓间充质干细胞能够在分级多孔的支架上保持很高的活性(96.0±3.3)％;⑦鬼笔环肽微丝骨架染色显示,骨髓间充质干细胞能够很好地在分级多孔的支架铺展开;⑧qRT-PCR结果显示,相比于普通的平板培养,支架能够促进骨髓间充质干细胞成软骨分化相关的基因表达.结论 脱细胞华通胶富含胶原、糖胺多糖等成分,低温沉积3D打印的脱细胞华通胶支架具有分级多孔的微观结构,具有良好的细胞相容性,有利于细胞的生长和黏附,并且可以促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化.