猪源Pdm/09 H1N1甲流NA定点突变拯救毒株的生物特性研究

目的 利用定点突变技术突变Pdm/09 H1N1流感病毒的NA基因119位点并拯救,研究其生物特性.方法 利用重叠PCR的方法进行定点突变,再应用反向遗传学体系中的pBD-NA质粒后在293T细胞中转染拯救流感病毒,通过血凝试验和RT-PCR方法鉴定病毒拯救结果,通过细胞学和攻毒试验研究该位点变异的生物学意义.结果 定点突变测序结果显示,突变的pBD-NA质粒核苷酸第336位由A突变为G,使氨基酸位点发生E(核苷酸:GAA)到G(核苷酸:GGA)的变化,而其他位置的氨基酸均未发生改变.拯救的病毒转染后的细胞悬液接种MDCK细胞连续传代3代后突变毒株(rMT)血凝效价为27,亲本毒株(rWT)为26.神经氨酸酶的二级结构预测结果显示,rMT与rWT相比,Alpha Helix分值明显下降,均值同比下降约为10.62％,经突变后的rMT Alpha Helix结构分值表现为下降趋势.用rWT和rMT病毒攻毒BABL/c小鼠后第3天的小鼠肺组织、鼻甲骨、脾和肾的病毒滴度,rMT攻毒组均比rWT攻毒组高,鼻甲组织与肺脏中的病毒滴度相比差异不显著,脾和肾的差异显著.结论 NA119位点的定点突变对病毒的复制能力没有明显影响,突变株对BABL/c小鼠的致病力有一定增强,临床症状明显,神经氨酸酶活性下降.