激素性股骨头坏死中甲基转移酶3介导谷胱甘肽过氧化酶7的m6 A修饰促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

目的 探讨在激素性股骨头坏死中甲基转移酶3(METTL3)介导的m6A修饰在骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化中的作用及其机制.方法 收集河南省人民医院2020年9月至2021年9月因激素性股骨头坏死或股骨颈骨折行髋关节置换患者的股骨骨髓液,满足纳入标准共23例,设激素性股骨头坏死患者为坏死组共12例,股骨颈骨折患者为对照组共11例,分离培养骨髓间充质干细胞(BMSC),利用聚合酶链反应(qRT-PCR)检测METTL3在两组BMSC中的表达水平;利用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测两组BMSC在培养24、48、72 h后的增殖活性;利用茜素红染色检测两组BMSC的成骨分化能力.利用METTL3过表达质粒上调坏死组细胞中METTL3的水平,并验证METTL3水平对坏死组BMSC增殖及成骨活性的影响,进一步通过转录组测序和m6A免疫共沉淀寻找METTL3调控的靶基因.两组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),通过Pearson相关系数检验METTL3与谷胱甘肽过氧化酶7(GPX7)之间的线性关系.结果 坏死组BMSC中m6A含量低于对照组细胞[(3.56±1.66)％比(14.94±2.48)％,t=12.150,P＜0.01],差异有统计学意义.qRT-PCR的结果显示METTL3在对照组BMSC表达量高于坏死组BMSC(1.13±0.04比0.44±0.06,t=5.579,P＜0.01),差异有统计学意义.CCK-8实验结果显示对照组BMSC培养24、48、72h后的吸光度值高于坏死组BMSC(0.41±0.03比0.26±0.02,t=6.759,P＜0.01,0.75±0.05 比 0.44±0.08,t=7.334,P＜0.01、1.38±0.07 比 0.51±0.02,t=9.206,P＜0.01),差异有统计学意义.茜素红染色显示对照组BMSC阳性染色面积/总面积高于坏死组BMSC(0.68±0.06比0.18±0.03,t=7.908,P＜0.01),差异有统计学意义.上调坏死组中METTL3表达水平后,CCK-8实验结果显示坏死组BMSC培养24、48、72 h后的吸光度值高于上调前坏死组细胞(0.61±0.04 比 0.23±0.02,t=6.433,P＜0.01、1.03±0.08 比 0.39±0.03,t=8.090,P＜0.01,1.62±0.11 比 0.55±0.06,t=9.387,P＜0.01),差异有统计学意义.同样地,茜素红染色显示坏死组过表达METTL3后的阳性染色面积/总面积高于过表达前(0.83±0.09比0.21±0.04,t=14.630,P＜0.01),差异有统计学意义.通过转录组测序发现,在BMSC中上调METTL3的表达水平后,GPX7的表达显著增高,m6A免疫共沉淀验证METTL3上调后GPX7 mRNA的m6A修饰水平高于坏死组细胞GPX7 mRNA的m6A修饰水平(2.85±0.85比0.97±0.18,t=10.260,P＜0.01),差异有统计学意义.结论 METTL3通过m6A修饰正向调控GPX7的表达水平,促进激素性股骨头坏死中BMSC的增殖和成骨分化.