羊传染性脓疱病毒LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种操作便捷、灵敏度高、特异性强且便于基层兽医检测羊传染性脓疱病毒(ORFV)的方法,本研究基于ORFV-VIR基因设计了外引物F3、B3和内引物FIP、BIP共2对引物,对其进行扩增并连接至载体pMD19-T,构建阳性质粒pMD19-T-VIR.通过设置60℃～67℃温度梯度,比较优化了检测ORFV的LAMP反应条件.比较普通PCR、RT-PCR与LAMP这三种检测方法的特异性和敏感性,选择最优检测方法应用于后续临床样品的检验.结果显示,LAMP检测63℃下孵育40 min,羟基萘酚蓝可通过肉眼直接观察测定结果;特异性结果显示,ORFV与山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、牛O型口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无交叉反应;敏感性分析LAMP最低检测量是PCR的10倍,为5.1×101copies/μL,与RT-PCR相同.临床样品检测结果显示,LAMP阳性检测率为38.346％,远高于普通PCR的阳性率(13.46％).结果表明,LAMP法具有检测操作简便、灵敏高、耗时少等优点,适合基层检测,可作为ORFV临床检测的候选方式.