华蟾毒精靶向KATNB1抑制肿瘤细胞微管形成和有丝分裂

华蟾素是临床广泛应用的抗肿瘤中药,但其抗肿瘤分子机制尚未完全清楚.本研究旨在阐明华蟾素活性成分华蟾毒精(cinobufagin,CBG)抑制肿瘤细胞有丝分裂的靶标及分子机制.应用碘化丙啶(PI)DNA染色法分析CBG对肿瘤细胞周期的作用;通过胸苷同步化细胞至有丝分裂时期,微管及中心粒染色法表征CBG对肿瘤细胞有丝分裂的影响;采用体外微管聚合实验、微管单体/聚体分离实验及微管α-tubulin荧光标记法从分子和细胞水平评价CBG对微管聚合的作用;通过基因编辑技术CRISPR/Cas9建立微管切割蛋白Katanin调节亚基B1(KATNB1)敲除的肿瘤细胞,CCK-8法考察CBG对野生型和敲除细胞抑制作用的差异;利用化学生物学的技术方法研究CBG和KATNB1的结合;采用Western blot及实时定量PCR检测CBG对KATNB1蛋白和mRNA的调控.结果发现,CBG阻滞结肠癌HCT116细胞周期于G2/M期;诱导中心粒异常增生,抑制肿瘤细胞的有丝分裂;体内外的微管形成实验表明CBG显著抑制微管蛋白聚合;KATNB1敲除后缓解了 CBG对HCT116细胞的抑制作用,表明KATNB1是CBG抗肿瘤的重要靶标;进一步发现CBG与KATNB1结合并减少其蛋白水平,KATNB1突变能阻断两者结合及CBG的这种作用.以上结果表明,CBG靶向微管切割蛋白KATNB1抑制微管聚合从而抑制肿瘤细胞有丝分裂.