抗乙型脑炎病毒NS1蛋白抗体的制备及其抗原定量ELISA检测方法的建立及验证

目的 制备抗乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)非结构蛋白NS1多克隆抗体和单克隆抗体,并建立针对JEV的抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,用于疫苗研制中抗原定量及质量控制.方法 原核表达制备重组蛋白JEV-NS1,纯化后免疫BALB/c小鼠和家兔,制备兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体.分别以兔多抗作为捕获抗体、HRP-JEns1C1鼠单抗作为检测抗体和鼠单抗JEns1C1作为捕获抗体、酶标兔多抗作为检测抗体,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度和检测抗体浓度,建立抗原定量ELISA检测方法.确定该方法的线性范围及灵敏度,并对其专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证.结果 制备了特异性好、效价高的抗JEV-NS1兔多抗和鼠单抗,以兔多抗作为捕获抗体、HRP-JEns1C1鼠单抗作为检测抗体建立了抗原定量ELISA检测方法.该方法在检测范围为250.0～4 000.0 ng/mL 时,R2不低于 0.99;高(2 000.0 ng/mL)、中(1 000.0 ng/mL)、低(500.0 ng/mL)3 个浓度样品准确度验证回收率为83.7％～103.4％;重复性验证变异系数(CV)分别为5.8％、3.8％、2.9％,中间精密度验证CV分别为5.7％、5.8％、5.3％;耐用性验证CV分别为3.7％、5.7％、5.3％;专属性验证结果显示,该方法只识别JEV-NS1抗原,与其他病毒无交叉反应.各项验证结果均符合乙型脑炎疫苗的质控要求.结论 建立的JEV-NS1抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法专属性、准确度、精密度、线性、耐用性均较好,可用于纯化过程样品的抗原检测,为乙型脑炎疫苗研制过程中抗原含量测定提供了质控方法.