非洲猪瘟病毒引物解旋酶C962R转录水平的动态分析及其互作病毒蛋白的鉴定

为筛选与非洲猪瘟病毒(ASFV)引物解旋酶C962R互作的病毒蛋白,本研究将ASFV Pig/HLJ/2018株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后20 h内每间隔2 h收获细胞,通过荧光定量PCR检测C962R基因的动态转录水平.结果显示,ASFV感染PAM后6 h C962R基因的转录水平明显增加,18h达峰值.经PCR扩增质粒pmCherry的mCherry基因、ASFV基因组中距C962R基因起始密码子41 bp(内含子部分)处上游约1 000 bp的基因序列、距C962R N端约1 000 bp的基因序列(该N端融合Strep标签)及C962R基因起始密码子上游的41 bp(内含子部分)基因序列后,构建重组质粒p3X-MCS-C962R-mCherry,并经双酶切鉴定正确后转染PAM,采用Pig/HLJ/2018株感染该PAM,48 h后分别收获上清液和细胞,采用PCR和western blot鉴定获得的重组病毒.结果显示,上清液中出现约1 000 bp的包含mCherry和Strep标签的基因片段及PAM中出现100 ku的特异性条带,表明获得了融合表达C962R蛋白和Strep标签的重组ASFV(rC962R-mCherry).将慢病毒包装质粒和辅助质粒共转染HEK 293T细胞,利用嘌吟霉素筛选融合表达C962R蛋白和Strep标签蛋白的细胞并经westernblot鉴定.结果显示,细胞中出现100 ku的特异性条带,表明获得了表达ASFV C962R蛋白的细胞PK-15-C962R-Strep.分别将rC962R-mCherry感染PAM、ASFV Pig/HLJ/2018株感染PK-15-C962R-Strep,通过这两种感染方式经Strep pull-down试验检测C962R蛋白及筛选与其互作的病毒蛋白,并经质谱鉴定互作病毒蛋白的种类.采用PCR将Strep标签融合于筛选出的病毒蛋白编码基因的C端,分别克隆至pCAGGS载体,获得分别表达各病毒蛋白的重组质粒.将表达各病毒蛋白的重组质粒分别与表达C962R-Strep的重组质粒共转染HEK293T细胞,36 h后采用Co-IP试验进一步验证获得的与ASFV C962R蛋白互作的病毒蛋白.Strep pull-down试验结果显示,rC962R-mCherry感染的PAM细胞、ASFV Pig/HLJ/2018株感染的PK-15-962-Strep细胞中均出现100ku的特异性条带.质谱鉴定结果显示,共筛选出3种病毒蛋白:A137R、K145R和K205R蛋白.Co-IP结果显示,IP样品中分别出现约16 bp、17bp的特异性条带,对应为病毒的A137R和K145R蛋白.表明仅有A137R和K145R蛋白与C962R蛋白存在相互作用.本研究为以C962R蛋白为靶蛋白的新型抗ASFV药物及疫苗的研发提供实验依据.