细菌外膜蛋白BamA突变体构建及位点运动性分析

目的 构建细菌外膜β桶状蛋白组装机器(BAM)核心组分BamA点突变原核表达载体,获得特定位点突变BamA蛋白,并分析该蛋白多肽易位相关(POTRA)结构域上G313位点运动特性.方法 利用重叠延伸PCR(SOE?PCR)将BamA蛋白第690和700位天然半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S),将POTRA结构域上第313位氨基酸由甘氨酸(G)突为C,构建含BamA?C690S?C700S?G313C突变的原核表达载体pET22b?Strep?BamA.异丙基?β?D?硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导突变蛋白表达后,利用Strep?Tactin Sepharose柱亲和层析方法对突变体蛋白进行纯化.甲烷硫代磺酸(MTSL)标记所得纯化蛋白的半胱氨酸后,进行电子顺磁共振(EPR)波谱检测,通过EPR波谱拟合获得旋转相关时间τc,分析G313C氨基酸位点的运动特性.结果 构建了BamA?C690S?C700S?G313C突变体原核表达载体,实现了突变体蛋白有效表达和纯化.G313C位点EPR波谱为单成分运动状态波谱,其τc值为(2.30±0.03)ns.结论 该研究建立了BamA点突变原核表达和蛋白纯化方法,并获得BamA蛋白G313C运动性特征参数,为进一步研究BamA蛋白在外膜蛋白整合过程中的结构机制提供了数据.