mRNA前体剪切因子19蛋白对乙型肝炎病毒感染Huh7细胞病毒复制的影响

目的 观察mRNA前体剪切因子19(pre-mRNA processing 19,PRP19)蛋白对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染Huh7细胞HBV核心启动子、EnhⅡ/基本核心启动子(basal core promoter,BCP)活性的影响,探讨其调控HBV复制的可能机制.方法 取对数生长期Huh7细胞分为PRP19过表达组(转染pcDNA3.1-Flag-PRP19过表达质粒和HBV B基因型表达质粒pUC19-HB-Bj),PRP19敲低组(转染PRP19-siRNA 36 h后转染pUC19-HB-Bj),空白对照组(转染NC-siRNA 36 h后转染pUC19-HB-Bj),正常对照组(转染pUC19-HB-Bj).转染72 h,4组采用Western blot法检测PRP19蛋白相对表达量,采用实时荧光定量PCR法检测HBV前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)和HBV-DNA相对表达量;采用Western blot法检测PRP19过表达组、正常对照组HBsAg、HBcAg蛋白相对表达量.取PRP19过表达组和正常对照组细胞,分别转染HBV核心启动子及EnhⅡ/BCP驱动的海肾荧光素酶报告质粒,转染48 h,测定2组HBV核心启动子、EnhⅡ/BCP荧光素酶活性;采用DNA pull down法检测PRP19与HBV核心启动子、EnhⅡ/BCP的关系.结果 PRP19过表达组PRP19蛋白相对表达量(0.92±0.11)高于正常对照组(0.08±0.06)(t=27.941,P＜0.001),PRP19 敲低组(0.13±0.05)低于空白对照组(0.51±0.10)(t=5.494,P=0.005);PRP19 过表达组pgRNA相对表达量(0.40±0.22)低于正常对照组(1.07±0.05)(t=7.173,P=0.002),PRP19敲低组(1.61±0.14)高于空白对照组(1.05±0.08)(t=10.504,P=0.005).PRP19 过表达组 HBsAg(0.35±0.09)、HBcAg(0.20±0.09)蛋白及 HBV-DNA(2.60×107±0.28)相对表达量均低于正常对照组(0.83±0.06、0.78±0.12、5.50×107±0.15)(t=13.204,P＜0.001;t=12.346,P＜0.001;t=11.232,P＜0.001).PRP19 过表达组 HBV 核心启动子(0.28±0.23)、EnhⅡ/BCP(0.16±0.12)荧光素酶活性均低于正常对照组(1.10±0.09、1.08±0.07)(t=9.864,P=0.005;t=21.342,P＜0.001).PRP19可与生物素标记的EnhⅡ/BCP探针相结合.结论 PRP19通过与HBV核心启动子上的EnhⅡ/BCP区相互作用,负向调控HBV核心启动子活性,抑制HBV感染Huh7细胞HBV转录.