阳春砂与海南砂BPPS启动子比较及GCN4-motif正调控作用的鉴定

目的 龙脑基二磷酸合酶（bornyl diphosphate synthase,BPPS）是砂仁药效萜类合成途径中的关键酶，获得海南砂Al BPPS的启动子并与阳春砂Av BPPS启动子进行调控元件和瞬时表达的比较，以期解析Av BPPS在种子中高表达的分子机制。方法 通过FPNI-PCR的方法从海南砂g DNA中克隆Al BPPS的启动子，并与阳春砂Av BPPS启动子进行序列比较，对启动子相似区域进行截短，获得其相应的截短片段；对Av BPPS启动子截短片段中的GCN4-motif进行突变；构建由上述启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuro-nidasegene,GUS）的重组表达载体，利用农杆菌介导法注射侵染本氏烟草叶片进行瞬时表达，验证启动子的活性和GCN4-motif的功能。结果 克隆获得365 bp的AlBPPS启动子序列，3’端约300 bp的序列与Av BPPS启动子的相应序列相似度高达93%，但AlBPPS启动子不含有AvBPPS启动子的GCN4-motif。构建成功与GUS报告基因融合的系列启动子重组载体——VBP∷GUS（Av BPPS启动子全长）、VBPT∷GUS（Av BPPS启动子截短至320 bp）、VBPT-GM∷GUS（截短Av BPPS启动子且突变GCN4-motif）和LBP∷GUS（Al BPPS启动子全长）、LBPT∷GUS（Al BPPS启动子截短至305 bp）。通过GUS染色发现虽然上述启动子均具有驱动GUS基因转录的活性，然而，含有GCN4-motif的启动子，包括全长或截短的Av BPPS启动子（VBP∷GUS和VBPT∷GUS）的活性均高于GCN4-motif突变（VBPT-GM∷GUS）或无GCN4-motif的启动子（LBP∷GUS和LBPT∷GUS）。结论 GCN4-motif对基因转录具有正调控作用，为进一步探究Av BPPS启动子的调控机制奠定了基础。