KRAS4AG12C和KRAS4BG12C对人肺上皮细胞生长和运动的作用差异及机制研究

目的·探究含有致癌突变KRASG12C的2种剪接体KRAS4AG12C和KRAS4BG12C促进人正常肺支气管上皮细胞生长和运动的差异,并初步探讨其分子机制.方法·在人正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B中通过慢病毒包装和感染构建KRAS4AG12C和KRAS4BG12C稳定过表达细胞株,蛋白质印迹法(Western blotting)检测模型是否构建成功,倒置相差显微镜观察细胞形态,实时动态细胞成像分析系统观察细胞增殖变化,细胞划痕及细胞迁移实验观察细胞运动的变化.机制探究上,使用RNA高通量测序方法(RNA-seq)对细胞全转录组水平进行测序,对测序结果进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析及基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA),寻找差异基因及信号通路变化,实时荧光定量PCR进一步验证.2组间比较采用student's t检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义.结果·KRAS4AG12C和KRAS4BG12C过表达均引起BEAS-2B细胞形态变化,有伪足状结构和细胞连接增加;BEAS-2B KRAS4BG12C细胞和BEAS-2B KRAS4AG12C细胞增殖能力均显著强于亲本BEAS-2B细胞;细胞划痕实验结果表明BEAS-2B KRAS4BG12C细胞伤痕愈合能力显著强于BEAS-2B KRAS4AG12C细胞(P=0.006),且显著强于BEAS-2B亲本细胞(P=0.000);Transwell实验结果表明BEAS-2B KRAS4BG12C细胞迁移能力显著强于BEAS-2B KRAS4AG12C细胞(P=0.048),且显著强于BEAS-2B亲本细胞(P=0.033);与BEAS-2B KRAS4AG12C细胞相比,BEAS-2B KRAS4BG12C细胞中细胞黏附分子相关信号通路显著上调(P=0.002);BEAS-2B KRAS4BG12C细胞紧密连接蛋白1(claudin 1,CLDN1)的mRNA水平显著高于BEAS-2B KRAS4AG12C细胞(P=0.000);BEAS-2B KRAS4BG12C细胞黏附分子3(cell adhesion molecule 3,CADM3)的mRNA水平显著高于BEAS-2B KRAS4AG12C细胞(P=0.000).结论·该文首次报道了含有致癌突变KRASG12C的2种剪接体KRAS4AG12C和KRAS4BG12C促进BEAS-2B细胞生长和运动能力的差异以及潜在的分子机制,即KRAS4AG12C和KRAS4BG12C均可促进人肺支气管上皮细胞BEAS-2B增殖,而且KRAS4BG12C促进肺上皮细胞BEAS-2B运动能力更强,可能与黏附相关基因CLDN1和CADM3表达水平更高相关,为KRAS特异性靶向抑制剂的研究提供了实验依据和理论基础.