胰高血糖素样肽-1受体敲除H9c2细胞株建立及其抗凋亡作用初探

目的 通过CRISPR/Cas9技术构建大鼠H9c2心肌细胞胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)基因敲除的稳转株,探讨甲基乙二醛对其凋亡的影响.方法 利用CRISPR/Cas9技术敲除H9c2心肌细胞的GLP-1R基因建立GLP-1R-/-H9c2细胞系,单克隆后通过测序和免疫印迹进行鉴定.H9 c2细胞为野生型(WT)组,GLP-1 R-/-H9 c2细胞为GLP-1 R-/-组.采用免疫荧光对两组细胞进行染色,电子显微镜观察细胞形态;采用甲基乙二醛对两组细胞进行干预,利用CCK-8检测细胞活力,JC-1检测线粒体膜电位,实时荧光定量PCR检测GLO1、Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA的表达.结果 基因测序及免疫印迹结果证实,GLP-1R-/-H9c2细胞系构建成功;免疫荧光染色显示GLP-1R-/-组细胞形态较WT组显著缩小(P<0.01);CCK-8检测结果显示,GLP-1R-/-组细胞活力较WT组显著降低(P<0.01);JC-1检测结果显示,GLP-1R-/-组细胞的线粒体膜电位损伤显著高于WT组(P<0.01);实时荧光定量PCR检测结果显示,GLP-1R-/-组细胞的Bax mRNA表达显著上调(P<0.01),Bcl-2 mRNA表达显著下调(P<0.01).而caspase-3 mRNA和GLO1 mRNA的表达在两组细胞间无显著差异(P>0.05).结论 在GLP-1R-/-基因敲除的H9c2细胞系中,GLP-1R蛋白缺失会影响H9c2细胞的细胞形态,降低细胞活力,损伤线粒体膜电位,增强甲基乙二醛诱导的凋亡,从而证明GLP-1 R蛋白在H9 c2细胞中的保护作用.