重组人降钙素原的制备及发酵优化

目的 制备人降钙素原(PCT)蛋白,用于抗体制备及检测试剂盒的研制.方法 通过分子克隆技术构建人PCT重组表达质粒(pET28a-PCT),以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞,进行PCT的原核表达,利用发酵罐进行大肠杆菌的高密度培养并优化发酵条件,镍柱纯化重组蛋白.标定重组蛋白水平后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)验证重组蛋白作为标准蛋白在绘制水平-吸光度标准曲线中的应用价值.结果 培养大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PCT,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,重组蛋白主要表达在细菌裂解上清液中.利用发酵罐优化溶氧量、补料及温度等参数,培养温度40℃,溶氧量设定为30％,10×肉汤(LB)浓缩培养基以100 mL/h速度加入补料,以IPTG终浓度0.2 mmol/L诱导4 h,PCT产量为1405 mg/L,镍柱亲和纯化后,纯度超过90％.用ELISA试剂盒标定重组蛋白.绘制水平-吸光度标准曲线,PCT与试剂盒提供的标准蛋白之间几乎没有差异.结论 该研究通过发酵表达及亲和纯化的方式,制备了高纯度的PCT蛋白,为PCT抗体的制备及PCT检测试剂盒的开发提供了重要原料.