健脾化瘀方体外通过外泌体影响肝癌细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化

目的 探讨健脾化瘀方(JHD)通过外泌体对肝癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化(EMT)的影响.方法 利用转化生长因子β1(TGF-β1)刺激MHCC97H细胞,构建肝癌细胞EMT模型.根据处理条件,将细胞分为4组,①对照组:不进行干预;②模型组:TGF-β1(10ng·mL-1);③JHD低浓度组:TGF-β1(10 ng·mL-1)＋健脾化瘀方(2 mg·mL-1);④JHD高浓度组:TGF-β1(10 ng·mL-1)+健脾化瘀方(4 mg·mL-1).干预48h后,采用超速离心法提取各组细胞培养上清液的外泌体,通过透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、Western Blot法检测外泌体标志蛋白(CD63、CD81、HsP70、CD9),以及外泌体内吞实验对外泌体进行鉴定.将提取的4组外泌体分别与MHCC97H细胞共培养24h/48h后,分离MHCC97H细胞,进行划细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验及Western Blot法检测EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin).结果 透射电镜下观察到外泌体的形态呈囊泡状,分布不一,有单个分布,也有聚集成组,背景清晰,无明显污染物,各组外泌体形态相近,无明显差异,直径在30～140nmn之间;纳米颗粒追踪分析仪检测到4组外泌体粒径的峰值在130～150 nm之间,与电镜观察结果基本一致;各组均可检测到外泌体标志蛋白CD63、CD81、HsP70、CD9表达.被PKH26标记的外泌体可被MHCC97H细胞重新吸收内化.与对照组比较,模型组的MHCC97H细胞迁移能力(24、48 h)及侵袭能力均显著增强(P＜0.01),E-cadherin蛋白表达显著下调(P＜0.01),Vimentin、N-cadherin蛋白表达显著上调(P＜0.01).与模型组比较,JHD高、低浓度组的MHCC97H细胞迁移能力(24、48 h)及侵袭能力显著减弱(P＜0.01),E-cadherin蛋白表达显著上调(P＜0.01),Vimentin、N-cadherin蛋白表达显著下调(P＜0.01).结论 健脾化瘀方体外可通过外泌体抑制MHCC97H细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化.