TNF-α诱导大鼠软骨细胞焦亡模型的建立与评价

目的 建立肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的大鼠软骨细胞焦亡模型并评价模型的特点.方法 两步酶消化法获取大鼠膝关节软骨细胞,倒置相差显微镜观察大鼠软骨细胞的形态结构,甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组化染色鉴定大鼠软骨细胞,用不同质量浓度TNF-α(5、10、20、40 ng/ml)诱导建立大鼠软骨细胞的焦亡模型,以TNF-α(0 ng/ml)为对照组.CCK-8法检测大鼠软骨细胞活力,West-ern blot检测大鼠软骨细胞焦亡信号相关蛋白,确定最佳刺激浓度,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β、IL-18的水平,免疫荧光检测大鼠软骨细胞gasdermin D(GSDMD)表达,扫描电镜观测大鼠软骨细胞焦亡的形态学改变.结果 与对照组相比,大鼠软骨细胞的活力随着TNF-α浓度升高而逐渐下降,并且核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱天冬酶1(caspase-1)、GSDMD、磷酸化核转录因子-κB p65(P-p65)蛋白的表达增加.TNF-α(20 ng/ml)可诱导大鼠软骨细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达上调,ColⅡ表达减少,GSDMD荧光表达增强,培养上清液中IL-1β、IL-18水平增加,关节软骨细胞肿胀,显微结构破坏.结论 成功建立大鼠软骨细胞焦亡模型.TNF-α(20 ng/ml)体外可致大鼠软骨细胞肿胀死亡,显微结构破坏,软骨基质降解,焦亡信号活化.