流感病毒感染A549细胞外泌体差异microRNA筛选及靶基因分析

目的:提取、鉴定甲型流感病毒(A/PR8/34,PR8)感染A549细胞外泌体,检测外泌体差异表达miRNA并进行靶基因预测、分析.方法:间接免疫荧光法检测PR8对A549细胞的感染率;超速离心法和免疫磁珠法提取、纯化PR8感染细胞外泌体(PR8-exos)及正常A549细胞外泌体(Con-exos);透射电镜观察外泌体形态和粒径大小;纳米粒径分析(NTA)检测外泌体粒径分布;Western blot检测外泌体标志蛋白;RNAseq检测外泌体差异表达miRNA;KEGG和GO富集分析差异miRNA靶基因.结果:100 TCID50的PR8对A549细胞感染率为100％;透射电镜观察PR8-exos及Con-exos均为杯托状双层膜小囊泡结构;PR8-exos和Con-exos粒径大小分布几乎一致,Con-exos浓度为8.3×1010 Particles/ml,PR8-exos浓度为1.6×1011 Particles/ml,PR8组外泌体浓度高于对照组;PR8-exos及Con-exos均检测出CD63、CD9和Hsp70蛋白表达,而未检测到calnexin;PR8-exos和Con-exos差异表达miRNA共84个,PR8-exos差异表达miRNA对应的靶基因主要富集于细胞增殖、凋亡、病毒复制、感染、免疫等生物学过程.结论:流感病毒感染可刺激A549细胞外泌体分泌,外泌体差异表达miRNA参与调控的靶基因涉及细胞增殖和凋亡、固有免疫及炎症反应、干扰素相关信号通路.