砷致人胚肺成纤维细胞氧化应激过程中m6A修饰的变化

[背景]砷可以通过触发氧化应激对机体产生毒作用,这一过程伴随表观遗传修饰的改变.[目的]探讨亚砷酸钠(NaAsO2)引起人胚肺成纤维细胞(HELF)氧化应激过程中的N6-甲基腺苷(m6A)修饰变化.[方法]使用不同浓度的NaAsO2(0、2.5、5、10、20μmol·L–1)处理HELF细胞48 h,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTS)法检测细胞活力;使用相应试剂盒检测氧化应激因子总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)的含量;酶联免疫吸附法检测细胞总RNA中的m6A甲基化水平;实时荧光定量PCR法检测m6A修饰酶:甲基转移酶样3(METTL3)、甲基转移酶样14(METTL14)、肾母细胞瘤1关联蛋白(WTAP)、脂肪量与肥胖相关蛋白(FTO)、Fe(II)和α-KG依赖的双加氧酶AlkB家族成员5(ALKBH5)、YTH结构域蛋白2(YTHDC2)、YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)、YTH结构域家族蛋白3(YTHDF3)的mRNA表达情况;Western blotting法检测METTL3、FTO、YTHDC2、YTHDF3、核因子E2相关因子2(NRF2)的蛋白表达情况.采用RNA甲基化免疫共沉淀-实时荧光定量PCR法(MeRIP-qPCR)检测NRF2 mRNA中m6A的富集情况.[结果]使用0、2.5、5、10、20μmol·L?1 NaAsO2处理细胞后,MTS实验结果显示,相较于对照组,20μmol·L?1组的细胞活力降低至84％(P<0.05).比色法检测结果显示,相较于对照组,10、20μmol·L?1组T-SOD活性降低(均P<0.05);2.5、10μmol·L?1组GSH-Px活性降低(均P<0.05);10、20μmol·L–1组MDA含量升高(均P<0.05).酶联免疫吸附法结果显示,0、2.5、5、10、20μmol·L–1组总体m6A甲基化水平依次为(0.193±0.023)％、(0.247±0.021)％、(0.253±0.006)％、(0.233±0.006)％、(0.262±0.010)％,相较于对照组,各组m6A甲基化水平均升高(均P<0.05).实时荧光定量PCR结果显示,相较于对照组,METTL3的mRNA相对表达量在NaAsO2浓度为2.5、10、20μmol·L–1时降低(均P<0.05),FTO的mRNA相对表达量在NaAsO2浓度为20μmol·L–1时降低(P<0.05),YTHDC2的mRNA相对表达量在NaAsO2浓度为10、20μmol·L–1时升高(均P<0.05),YTHDF3的mRNA相对表达量在NaAsO2浓度为2.5、10、20μmol·L–1时升高(均P<0.05).Western blotting结果显示,相较于对照组,METTL3的蛋白相对表达量在NaAsO2浓度为10、20μmol·L–1时降低(均P<0.05),FTO的蛋白相对表达量在NaAsO2浓度为5、20μmol·L–1时降低(均P<0.05),YTHDC2的蛋白相对表达量在NaAsO2浓度为20μmol·L–1时降低(P<0.05),NRF2的胞核蛋白相对表达量在NaAsO2浓度为10、20μmol·L–1时降低(均P<0.05).MeRIP-qPCR结果显示,相较于对照组,20μmol·L–1 NaAsO2暴露组的m6A富集比例明显增加(P<0.05).过表达FTO后,FTO组FTO的mRNA及蛋白相对表达量较对照组升高,NRF2的胞核蛋白相对表达量较对照组升高(均P<0.05);NaAsO2+FTO组的FTO的mRNA及蛋白相对表达量较NaAsO2组明显升高(均P<0.05),NRF2的胞核蛋白相对表达量较NaAsO2组升高(P<0.05).[结论]NaAsO2引起HELF细胞发生氧化应激过程中,总体m6A甲基化程度、m6A修饰酶、NRF2 mRNA的m6A修饰以及NRF2的表达发生变化.