肠炎沙门菌glpK基因缺失株的生物学特性及其免疫效果评价的研究

为分析甘油激酶(GlpK)对肠炎沙门菌毒力的影响,本研究使用野生菌株c50336和glpK基因缺失菌株c50336ΔglpK进行体外模拟应激试验,分析glpK基因缺失对沙门菌抵抗应激环境的影响.将这两株菌分别以MOI 100感染鼠源巨噬细胞Raw264.7,在不同时间点计算胞内存活的细菌数,以评价glpK基因的缺失对沙门菌胞内存活率的影响;将菌株c50336和c50336ΔglpK腹腔注射小鼠,利用寇氏法计算各菌株对小鼠的半数致死量(LD50).结果显示,与c50336相比,c50336ΔglpK在氧化和高渗环境中的存活率极显著降低(0.001＜P＜0.01),但在酸性和碱性环境中的存活率无明显变化,且在巨噬细胞内的存活率明显降低;LD50测定结果显示,c50336ΔglpK和c50336对小鼠的LD50分别为1.6×107 cfu和6.7×102 cfu.将菌株c50336ΔglpK以2.1×106 cfu/只的剂量免疫BALB/c小鼠,14d后二免,首免28d时,以1.5×105cfu/只注射菌株c50336,计算15 d内小鼠的免疫保护率;按上述方法免疫小鼠一次,分别在免疫后3d、10d和21d,对各组小鼠采血分离血清,经间接ELISA检测小鼠血清抗体水平;取脾脏称重,计算脾脏指数;采用细菌计数法测定小鼠脾脏载菌量;制备免疫小鼠脾淋巴细胞悬液,分别经c50336ΔglpK全菌蛋白和ConA刺激,72 h后采用MTT法检测各组小鼠脾细胞的增殖能力.免疫保护率结果显示,glpK缺失株可对免疫小鼠提供100％的保护率,而攻菌对照组小鼠在攻菌后12d全部死亡.脾脏指数和载菌量检测结果显示,与对照组相比,免疫后3d、10 d和21d的免疫组小鼠脾脏指数均极显著升高(0.001＜P＜0.01),且10d时脾脏指数最高;小鼠脾脏载菌量逐渐降低,并在免疫后21d脾脏细菌被完全清除.血清抗体检测结果显示,免疫组小鼠抗体水平随免疫次数的增加而升高,而对照组小鼠血清抗体一直为阴性.淋巴细胞增殖能力检测结果显示,c50336ΔglpK全菌蛋白刺激的小鼠脾细胞增殖指数随免疫次数的增加而升高,与对照组差异均极显著(0.001＜P＜0.01).本研究结果首次证实glpK与肠炎沙门菌的毒力密切相关,且其缺失菌株可对小鼠提供良好的免疫保护.本研究为肠炎沙门菌glpK缺失株疫苗的研究奠定了基础.