布鲁氏菌BspG基因缺失对其部分生物学活性影响的研究

为探究布鲁氏菌BspG基因在布鲁氏菌胞内循环感染中的作用,本研究利用PCR方法扩增流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308株BspG基因上、下游同源臂及卡那基因片段,利用融合PCR将上述3个基因片段融合后克隆至pMD19-T载体中构建重组质粒pMD19-BspG-Kan;同时从B.abortus2308株中扩增BspG基因并克隆至pBBR1MCS-4载体中,构建重组质粒pBBR1MCS-4-BspG.上述两种质粒均经PCR及测序鉴定.将pMD19-BspG-Kan电转化至B.abortus 2308株中,24 h后利用Kan筛选BspG基因缺失株(ΔBspG),并经PCR鉴定;将pBBR1MCS-4-BspG转化ΔBspG菌株,经Kan+、AMP+抗性平板筛选BspG基因回补株(pBspG),并经PCR及测序鉴定.将上述两株菌连续传15代后分别利用PCR方法鉴定其的遗传稳定性;通过检测不同培养时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两株菌与亲本菌株的生长特性;按照MOI 100将ΔBspG、pBspG和亲本株分别感染RAW 264.7细胞后不同时间,通过检测细胞内的细菌数量分析各菌株的粘附与侵袭能力(感染后15 min、30min、45 min、60min)和胞内生存能力(感染后4h、8h、12h、24h、48h).PCR鉴定结果显示,分别获得了基因缺失株ΔBspG和回补株pBspG且这两株菌分别传至15代后均未出现回复突变现象,表明ΔBspG和pBspG的遗传稳定性均较强;生长曲线结果显示,ΔBspG和pBspG的体外生长趋势明显慢于亲本株;粘附与侵袭力试验结果显示,侵染巨噬细胞1h内,ΔBspG和pBspG的胞内存活数均与亲本株无显著差异,表明敲除BspG不影响细菌的粘附与侵袭能力;侵染巨噬细胞24h内,ΔBspG与亲本株的胞内活菌数无显著差异(P＞0.05),而24 h后ΔBspG的胞内活菌数极显著低于亲本株(P＜0.01).本研究结果首次表明BspG基因缺失降低了布鲁氏菌的胞内增殖能力,为研究BspG基因在布鲁氏菌致病机理中的作用奠定基础.