牛呼吸道合胞体病毒G蛋白特异性核酸适配体的筛选及初步应用

为筛选牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白特异性核酸适配体,本研究通过原核系统表达G蛋白,并利用软件设计引物,由公司合成初始寡核苷酸文库,并利用微孔板法,经过包被G蛋白、封闭后加入初始寡核苷酸文库、洗脱、酚抽取法提取、PCR扩增、胶回收以及反筛等操作经不同轮次筛选核酸适配体.在每轮筛选循环中,以回收产物为模板进行常规PCR扩增后再进行一轮非对称PCR扩增,获得目的条带大小为84 bp的单链核苷酸分子,用于下一轮筛选.共进行了11轮筛选,从第5轮开始反筛.将最后一轮筛选得到的对称PCR产物连接T载体后转化到DH5α感受态细胞中,经菌液PCR鉴定和测序后,利用间接酶联核酸适配体法(i-ELAA)选择测序结果出现频次较高的适配体,测定其与G蛋白的结合力,并利用软件预测其二级结构.结果显示,本实验表达了 BRSV重组G蛋白,经微孔板法筛选出了 98条适配体序列,其中G-6、G-13、G-39、G-55和G-72适配体出现频率最高;二级结构预测显示,5条核酸适配体均具有稳定的茎环状或发卡状结构,能与G蛋白特异、稳定的结合.本研究筛选出的5条核酸适配体为BRSV酶联核酸适配体法的建立奠定了基础.